新型腔肠素底物及其使用方法 [0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求于2010年11月2日提交的美国临时申请号61/409，422的优先权，其以其整体通过引用并入本文。 [0003] 背景 [0004] 已显示从深海奸细角刺奸(Oplophorus gracilirostris)分泌的突光素酶具有许多令人感兴趣的特点，比如高活性、高量子产量和宽泛的底物特异性(包括，例如，腔肠素(coelenterazine)以及多种腔肠素类似物)。当腔肠素(底物)与分子氧的氧化由刺虾属荧光素酶催化时，发生刺虾属的生物发光反应，导致462nm处的最大强度的光和产物CO2和 coelenteramide (Shimomura 等，Biochemistry, 17:994(1978))。最佳发光在 40°C 下在0.05-0.1M NaCl存在下在pH9时发生，并且，由于该酶对热的独特的耐性，当使用高纯度的酶时，可见发光在高于50°C的温度下发生，或当使用部分纯化的酶时，在高于70°C时发生。在pH8.7时，Shimomura等(1978)报道天然荧光素酶具有约130kDa的分子量，显然每个包括4个31kDa的单体；在较低pH时，天然荧光素酶趋于聚合。 [0005] 近期研究已显示细角刺虾荧光素酶是35kDa和19kDa天然蛋白质的复合物，S卩，由两个19kDa组分和两个35kDa组分组成的异四聚体。Inouye等(2000)报道了编码刺奸属荧光素酶的35kDa和19kDa蛋白质的cDNA的分子克隆，和催化发光反应的蛋白质组分的鉴定。编码所述蛋白质的cDNA在细菌细胞和哺乳动物细胞中表达，且19kDa蛋白质被鉴定为能够催化腔肠素的发光氧化反应的组分(Inouye等，2000)。 [0006] 刺虾属荧光素酶的19kDa蛋白(GenBank登录号BAB13776，196个氨基酸)似乎是具有荧光素酶功能的最小的催化组`分，且其一级结构与包括咪唑并吡嗪酮荧光素酶的任何所报道的荧光素酶不具有显著相似性(Lorenz等，PNAS USA, 88:4438 (1991) ；Thompson等，PNASUSA，86:6567 (1989))。19kDa蛋白质在大肠杆菌(E.coli)中的表达导致了包涵体的形成(Inouye 和 Sasaki, Protein Expression and Purification, 56:261-268 (2007))。包涵体的形成可能由于蛋白质的不稳定性导致。 [0007] 刺奸属萤光素酶的底物特异性出乎意料地广泛(Inouye和Shimomura.BBRC223:349 (1997))。例如，双脱氧腔肠素(bisdeoxycoelenterazine)(即，腔肠素-hh)，一种腔肠素类似物，是与腔肠素相当的刺虾属荧光素酶的极佳底物(Nakamura等，Tetrahedron, Lett.,38:6405(1997))。并且,刺奸属突光素酶是分泌的酶，与海相介形虫希根海萤(Cypridina (Vargula) hiIgendorfii)的突光素酶相似(Johnson 和 Shimomura,Meth.Enzyme, 57:331 (1978))，其也使用咪唑并吡嗪酮型荧光素来发光。 [0008] 概述 [0009] 在一方面，本公开涉及式(Ia)或(Ib)的化合物: [0010]  [0011]或 [0012] [0013] 其中R2选自由以下组成的组: 直链烷基； [0015] R6 选自由-H、-OH、-NH2、-OC (O) R 或-OCH2OC (O) R 组成的组； [0016] R8选自由以下组成的组: [0017] H或低级环烷基； [0018] 其中R3和R4均为H或均为CV2烷基； [0019] W 为-NH2、卤代、-OH、-NHC (O) R、-CO2R ； [0020] X 为-S-、-O-或-NR22-；[0021] Y 为-H、-OH 或-OR11 ; [0022] Z 为-CH-或-N-； [0023]每个 R11 独立地为-C (O) R，’ 或-CH2OC (O) R，’ ； [0024] R22 为 H、CH3 或 CH2CH3 ； [0025] 每个R独立地为Cu直链烷基或Cu支链烷基； [0026] R’ ’为CV7直链烷基或CV7支链烷基； [0027] 虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的； [0028]前提条件是当R2为, 或 时，R8 不为 [0029] 如提条件是当R2为 时，R8是 或低级环焼基；和 [0030] 如提条件是当R6为NH2时，R2为 或C2-5焼基； [0031]或R8 不为 [0032] 在另一方面，公开内容涉及选自以下的化合物: [0033] [0034] 在一方面，本公开涉及以下的式的化合物: [0036] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽具有增强的发光。 [0037] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID N0:3的OgLuc多肽具有增强的发光，前提条件是由多核苷酸编码的多肽不是表47中所列的那些其中之 O [0038] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO: 31的多肽具有增强的发光，前提条件是由多核苷酸编码的多肽不为SEQ ID N0:3或15。 [0039] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO: 29的多肽具有增强的发光，前提条件是由多核苷酸编码的多肽不为SEQ ID N0:3或15。 [0040] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1的OgLuc多肽具有至少80%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，所述OgLuc变体多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸置换 A4E、Q11R、A33K、V441、P115E、Q124K、Y1381、N166R、I90V、F541、Q18L、F68Y、L72Q和M75K，且所述OgLuc变体多肽具有荧光素酶活性。 [0041] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1的OgLuc多肽具有至少80%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，其中对应于SEQ ID NO:1的第4位的氨基酸为谷氨酸，第11位的氨基酸为精氨酸，第18位的氨基酸为亮氨酸，第33位的氨基酸为赖氨酸，第44位的氨基酸为异亮氨酸，第54位的氨基酸为异亮氨酸，第68位的氨基酸为酪氨酸，第72位的氨基酸为谷氨酰胺，第75位的氨基酸为赖氨酸，第90位的氨基酸为缬氨酸，第115位的氨基酸为谷氨酸，第124位的氨基酸为赖氨酸，第138位的氨基酸为异亮氨酸，和第166位的氨基酸为精氨酸，且所述OgLuc变体多肽具有荧光素酶活性。 [0042] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1的OgLuc多肽具有至少80%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，所述OgLuc变体多肽包括对应于SEQ IDNO:1 的氨基酸置换 A4E、Q11R、A33K、V441、P115E、Q124K、Y1381、N166R、Q18L、F541、L92H和Y109F，且所述OgLuc变体多肽具有荧光素酶活性。 [0043] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1的OgLuc多肽具有至少80%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，所述OgLuc变体多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸置换 A4E、Ql IR、A33K、V441、A541、F77Y、I90V、Pl 15E、Q124K、Y138I 和 N166R,且OgLuc变体多肽具有荧光素酶活 性。 [0044] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1的OgLuc多肽具有至少80%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，其中对应于SEQ ID NO:1的第4位的氨基酸为谷氨酸，第11位的氨基酸为精氨酸，第18位的氨基酸为亮氨酸，第33位的氨基酸为赖氨酸，第44位的氨基酸为异亮氨酸，第54位的氨基酸为异亮氨酸，第92位的氨基酸为组氨酸，第109位的氨基酸为苯丙氨酸，第115位的氨基酸为谷氨酸，第124位的氨基酸为赖氨酸，第138位的氨基酸为异亮氨酸，和第166位的氨基酸为精氨酸，且OgLuc变体多肽具有荧光素酶活性。 [0045] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1的OgLuc多肽具有至少80%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽的分离的多核苷酸，其中对应于SEQ ID NO:1的第4位氨基酸为谷氨酸、第11位氨基酸为精氨酸，第33位氨基酸为赖氨酸，第44位氨基酸为异亮氨酸，第54位氨基酸为异亮氨酸，第77位氨基酸为酪氨酸，第90位氨基酸为缬氨酸，第115位氨基酸为谷氨酸，第124位氨基酸为赖氨酸，第138位氨基酸为异亮氨酸，和第166位氨基酸为精氨酸，且OgLuc变体多肽具有荧光素酶活性。 [0046] 在一方面，本公开涉及包括编码SEQ ID NO: 19的多肽的多核苷酸的分离的多核苷酸。[0047]在一方面，本公开涉及包括 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:24, SEQID NO:25, SEQ IDNO:42, SEQ ID N0:88或SEQ ID N0:92的多核苷酸的分离的多核苷酸。 [0048] 在一方面，本公开涉及编码与SEQ ID NO:1具有至少30%氨基酸序列同一性的十足类荧光素酶多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包括对应于式(VII)的序列模式的序列模式且包括不超过5个差异，其中差异包括根据表4中所列的OgLuc模式相对于式(VII)的模式位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17或18的差异，以及根据表4中所列的OgLuc模式在式(VII)的任何模式位置之间的空位或插入，其中所述十足类荧光素酶在腔肠素存在下产生发光。 [0049] 在一方面,本公开涉及编码OgLuc变体多肽的合成的核苷酸序列,所述OgLuc变体多肽包括与具有SEQ ID NO: 2的亲代核酸序列具有80%或更低的核酸序列同一性且与SEQID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID N0:24 或 SEQ ID NO:25 具有 90% 或更高的核苷酸序列同一性的至少100个核苷酸的片段或其互补物，其中所述降低的序列同一性是合成的核苷酸序列中相对于亲代核酸序列中的密码子不同的密码子的结果，其中所述合成的核苷酸序列编码与由亲代核酸序列所编码的对应的荧光素酶具有至少85%氨基酸序列同一性的OgLuc变体，和其中所述合成的核苷酸序列相对于所述亲代核酸序列具有减少的数目的调控序列。 [0050] 在一方面,本公开涉及编码OgLuc变体多肽的合成的核苷酸序列,所述OgLuc变体多肽包括与具有SEQ ID NO: 14的亲代核酸序列具有80%或更低的核酸序列同一性且与SEQID NO: 22或SEQ ID NO: 23具有至少90%或更高的核酸序列同一性的至少300个核苷酸的片段或其互补物，其中所述降低的序列同一性是所述合成的核苷酸序列中相对于所述亲代核酸序列中的密码子不同的密码子的结果，其中所述合成的核苷酸序列编码与由所述亲代核酸序列所编码的对应荧光素酶具有至少85%氨基酸序列同一性的萤火虫荧光素酶，且其中所述合成的核苷酸序列相对于所述亲代核酸序列具有降低的数目的调控序列。 [0051 ] 在一方面,本公开涉 及编码OgLuc变体多肽的合成的核苷酸序列,所述OgLuc变体多肽包括与具有SEQ ID NO: 18的亲代核酸序列具有80%或更低的核酸序列同一性且与SEQID NO: 24或SEQ ID NO: 25具有90%或更高的核酸序列同一性的至少100个核苷酸的片段或其互补物，其中所述降低的序列同一性是所述合成的核苷酸序列中相对于所述亲代核酸序列中的密码子不同的密码子的结果，其中所述合成的核苷酸序列编码与由所述亲代核酸序列所编码的对应的荧光素酶具有至少85%氨基酸序列同一性的OgLuc变体，和其中所述合成的核苷酸序列相对于所述亲代核酸序列具有降低的数目的调控序列。 [0052] 在一方面，本公开涉及与异源蛋白融合的来自细角刺虾的信号肽的融合肽，其中所述信号肽是SEQ ID NO:54，其中所述融合肽在细胞中表达并从该细胞分泌。 [0053] 在一方面，本公开涉及生成编码OgLuc变体多肽的多核苷酸的方法，所述方法包括:(a)利用包括亲代OgLuc多肽和至少一种异源多肽的亲代融合蛋白构建体来生成变体融合蛋白的文库；和(b)对该文库筛选相对于亲代融合蛋白构建体具有增强的发光、增强的酶稳定性或增强的生物相容性中的至少一项。 [0054] 在一方面，本公开涉及生成编码用于生物体的荧光素酶的密码子优化的多核苷酸的方法，所述方法包括:对于荧光素酶中的每个氨基酸，从生物体中所用的最常用的两种密码子中随机选择密码子以编码所述氨基酸以产生第一密码子优化的多核苷酸。[0055] 本发明的其他方面将通过考虑详细描述和附图而变得明显。 [0056] 附图简述 [0057] 图1显示了天然腔肠素、已知的双-腔肠素(腔肠素_hh)和已知的腔肠素_h的化学结构，其中R2、R6和R8代表作出修饰的分子的区域。 [0058] 图 2 显示了新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3889、PB1-3945、PB1-4002、PB1-3841、PB1-3897、PB1-3896、PB1-3925、PB1-3894、PB1-3932 和 PB1-3840 的化学结构。 [0059]图 3 显示了 PB1-3939 的 Km 确定。 [0060] 图4显示了本发明的多种新颖腔肠素的化学结构。 [0061] 图5A-G显示了利用天然的、已知的和新型的腔肠素作为底物从裂解的表达C1+A4E的细菌细胞中生成的发光(RLU)。图5A、5C-5G显示了利用天然腔肠素作为比较，关于已知的和新型的腔肠素测量通过C1+4AE生成的以RLU为单位的发光的独立的实验。图5B显示了与天然腔肠素相比较，利用图5A中显示的底物通过C1+4AE生成的发光的成倍下降。 [0062] 图6A-D显示了利用天然腔肠素(“Coelente”)、已知的腔肠素_h( “h”)，已知的腔肠素_hh( “h，h”)，已知的2-甲基腔肠素(“2-me”)，已知的腔肠素_v( “v”)和新型腔肠素 PB1-3840、PB1-3897、PB1-3889、PB1-3899、PB1-3900、PB1-3912、PB1-3913、PB1-3925、PB1-3897、PB1-3899、PB1-3889, PB1-3939, PB1-3933、PB1-3932、PB1-3946、PB1-3897、PB1-3841、PB1-3896、PB1-3925和PB1-3945作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0063] 图7显示了不同的OgLuc变体中的氨基酸置换。 [0064] 图SA-B显示了利用 天然腔肠素(“Coelenterazine”)、已知的腔肠素_h( “H”)、已知的腔肠素-hh( “h，h”)、和新型腔肠素 PB1-3840、PB1-3925、PB1-3912、PB1-3889,PB1-3939,PB1-3933,PB1-3932,PB1-3946,PB1-3941 和 PB1-3896 作为底物从裂解的表达图7中所列的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0065] 图9显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_hh( “h，h”)和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3840、PB1-3932、PB1-3925、PB1-9894 和 PB1-3896 作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0066] 图10显示了不同的OgLuc变体中的氨基酸置换。 [0067] 图11显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_hh( “h，h”)和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3840、PB1-3932、PB1-3925、PB1-3894 和 PB1-3896 作为底物从裂解的表达图10中所列的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0068] 图12显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_hh( “h，h”)和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889、PB1-3840、PB1-3932、PB1-3925、PB1-3894、PB1-3896和PB1-3897作为底物从裂解的表达OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0069] 图13显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_hh( “H，H”)和新型腔肠素PB1-3897、PB1-3896和PB1-3894作为底物从裂解的表达OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0070] 图14显示了不同的OgLuc变体中的氨基酸置换。 [0071] 图15显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_hh( “h，h”)和新型腔肠素PB1-3897、PB1-3841、PB1-3896和PB1-3894作为底物从裂解的表达图14中所列的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0072] 图16显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_h( “H”)、已知的腔肠素-hh( “HH”)和新型腔肠素PB1-3841和PB1-3897作为底物从裂解的表达OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0073] 图17显示了利用天然腔肠素(“Coel”)、已知的腔肠素_hh( “h，h”)和新型腔肠素PB1-3897和PB1-3841作为底物从裂解的表达OgLuc变体和人源化的海肾属(Renilla)荧光素酶(hRL)的细菌细胞中生成的发光。 [0074] 图18显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_hh( “h，h”)和新型腔肠素PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889和PB1-4002作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0075] 图19显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)，已知的腔肠素_h( “H”)，已知的腔肠素-hh( “h，h”)和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889 和 PB1-4002 作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0076] 图20显示了 OgLuc变体中的氨基酸置换。 [0077] 图21显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_h( “H”)，已知的腔肠素-hh ( “h, h”)和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-4002、PB1-3932 和 PB1-3840 作为底物从裂解的表达图20中所列的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0078] 图22显示了不同的OgLuc变体中的氨基酸置换。 [0079] 图23显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_h( “H”)、已知的腔肠素-hh ( “h, h” )和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889、PB1-4002、PB1-3932 和PB1-3840作为底物从裂解的表达图22中所列的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0080] 图24显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_h( “H”)、已知的腔肠素-hh( “H，H”)和新型腔肠素PB1-3939和PB1-3945作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体和hRL( “海肾属”)的细菌细胞中生成的发光。 [0081] 图25利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_hh( “h，h”)和新型腔肠素PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889和PB1-4002作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0082] 图26显示了不同的OgLuc变体中的氨基酸置换。 [0083] 图27显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的腔肠素_h( “H”)、已知的腔肠素-hh( “h，h”)和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889 和 PB1-4002 作为底物从裂解的表达图26中所列的OgLuc变体的细菌细胞中生成的发光。 [0084] 图28显示了利用天然腔肠素(“Coel.”)、已知的腔肠素_h( “H”)、已知的腔肠素-hh( “H，H”)和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889 和 PB1-4002 作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体和hRL( “海肾属”)的细菌细胞中生成的发光。 [0085] 图29显示了利用天然腔肠素和PB1`-3939作为底物细菌裂解物中的9B8opt和9B8opt+K33N的发光，和与天然腔肠素相比较这些变体对于PB1-3939的相对特异性。 [0086] 图30A-D显示了利用天然腔肠素(图30A)、腔肠素_h(图30B)和PBI_399(图30C)在第166位处的突变分析。[0087] 图31显示了 OgLuc变体L27V中的不同的缺失的发光，其中(-)是机器背景。 [0088] 图32显示了利用天然腔肠素作为底物从裂解的表达hRL( “海肾属”)的HEK293细胞中生成的标准化的发光、利用荧光素(BRIGHT-GL0™测定试剂)作为底物从裂解的表达萤火虫荧光素酶(Luc2)的HEK293细胞中生成的标准化的发光和利用新型PB1-3939作为底物从裂解的表达不同的OgLuc变体的HEK293细胞中生成的标准化的发光。 [0089] 图33显示了利用新型腔肠素PB1-3945作为底物细菌裂解物中的IV和15C1的信号稳定性和利用新型腔肠素PB1-3889作为底物细菌裂解物中的IV和9B8的信号稳定性。 [0090] 图34A-B显示了与萤火虫荧光素酶(Fluc)和海肾属荧光素酶(Rluc)相比较OgLuc变体L27V的较高的活性(图34A)和信号稳定性(图34B)。 [0091] 图35显示了利用新型腔肠素PB1-3939作为底物细菌裂解物中不同的OgLuc变体的 Vmax (RLU/ 秒)和 Km ( μ M)值。 [0092] 图36显示了利用新型腔肠素ΡΒΙ-3939作为底物细菌裂解物中不同的OgLuc变体的 Vmax (RLU/ 秒)和 Km ( μ Μ)值。 [0093] 图37显示了利用新型腔肠素ΡΒΙ-3939作为底物细菌裂解物中的9B8opt和9B8opt+K33N 两者的 Vmax (RLU/ 秒)和 Km( μ M)值。 [0094] 图38显示了利用天然腔肠素作为底物细菌裂解物中的不同的OgLuc变体在50°C时的蛋白稳定性，t=0处的发光和以分钟为单位的半衰期。 [0095] 图39A-B显示了与海肾属荧光素酶(hRL)和萤火虫荧光素酶(Luc2)相比较在250C (图39A)和37°C (图39B)下细菌裂解物中不同的OgLuc变体的结构完整性(通过表达、稳定性和溶解性来确定，如通过SDS-PAGE分析所示)。 [0096] 图40A-B显示了利用新型腔肠素PB1-3939作为底物细菌裂解物中的9B8opt和9B8opt+K33N在60°C下的蛋白稳定性，随时间推移发光(以RLU为单位)的自然对数(In)(图40A)和以小时为单位的半衰期(图40B)。 [0097] 图41显示了 60°C下OgLuc变体9B8和L27V的活性的百分比。 [0098] 图42A-B显示了不同的pH(图42A)和盐浓度(图42B)下OgLuc变体L27V的蛋 白稳定性。 [0099] 图43A-B显示了纯化的C1+A4E (图43A)和9B8 (图43B)的凝胶过滤色谱分析。 [0100] 图44显示了表明OgLuc变体L27V以单体形式存在的凝胶过滤色谱分析。 [0101] 图45A-B显示了通过SDS-PAGE分析(图45A)，未稀释的和1:1稀释的细菌裂解物样品中的不同的OgLuc变体-HALOTAG⑧(HT7)融合蛋白的蛋白表达水平，和标准化的蛋白表达水平(图45B)。 [0102] 图46A-B显示了 OgLuc变体9B8opt、V2和L27V的蛋白表达(图46A)和溶解度(图 46B)。 [0103] 图47显示了利用天然腔肠素和新型腔肠素PB1-3939作为底物从裂解的表达IV、9B8和hRL( “海肾属”)的HEK293细胞中生成的以RLU为单位的标准化的发光。 [0104]图 48 显示了分别利用 PB1-3939、Luciferin(BRIGHT-GL0™ 测定试剂)和天然腔肠素作为底物从裂解的表达pF4Ag-0gluc-9B8-HT7、pF4Ag-Luc2-HT7和pF4Ag-Renilla-HT7的HEK293细胞中生成的以RLU为单位的标准化的发光。 [0105] 图49显示了利用新型腔肠素PB1-3939作为底物，从裂解的表达编码9B8opt或9B8opt+K33N( “K33N”)的30ng或IOOng的质粒DNA的HEK293细胞中生成的发光。 [0106] 图50A-E显示了在HEK293细胞(图50A)和HeLa细胞(未融合)中(图50B)与萤火虫荧光素酶(Luc2)相比较OgLuc变体L27V的发光，在HEK293( “HEK”)和HeLa细胞(“HeLa”)中，与OgLuc变体L27V(图50C)和萤火虫荧光素酶(Luc2)(图50D)相比较 HaloTag®融合体的发光，和与HaloTag® -萤火虫荧光素酶(Luc2)相比较HaloTag® -0gLucL27V的蛋白表达。 [0107] 图51显示了针对LOPAC文库OgLuc变体9B8和L27V的抑制分析以确定其对于脱靶相互作用的敏感性。 [0108] 图52A-E显示了通过苏拉明和Tyr ag835对OgLuc变体9B8和L27V的抑制分析(图52A-C)以及苏拉明 (图52D)和Tyr ag835 (图52E)的化学结构。 [0109] 图53显示了分析在BSA存在下OgLuc变体9B8和L27V的活性以确定对非特异性蛋白相互作用的抵抗力。 [0110] 图54显示了 OgLuc变体9B8和L27V的活性百分比以确定对塑料的反应性。 [0111] 图55显示了利用已知的腔肠素-h作为底物与hRL( “海肾属”)相比较在用毛喉素处理(“诱导的”)和未用毛喉素处理(“基底的”)时从裂解的表达IV CAMP转录报告子的HEK293细胞中生成的发光，和由于毛喉素处理导致的倍数诱导(应答)(“倍数”)。 [0112] 图56显示了利用PB1-3939(对于9B8和9B8opt)、天然腔肠素(对于hRL)或荧光素(BRIGHT-GL0™测定试剂；对于Luc2)作为底物在用毛喉素处理(“+FSK”)或未用毛喉素处理(“-FSK”)时从裂解的表达9B8、9B8opt、hRL( “海肾属”)或萤火虫荧光素酶(“Luc2”)cAMP转录报告子的HEK293细胞中生成的标准化的发光，和由于毛喉素处理导致的倍数诱导(应答“倍数”)。 [0113] 图57显示了利用新型腔肠素PB1-3939作为底物在用毛喉素处理(“诱导的”)或未用毛喉素处理(“基底的”)的情况下从裂解的表达9B8opt和9B8opt+K33N( “K33N”)cAMP转录报告子的HEK293细胞中生成的发光，和由于毛喉素处理导致的倍数诱导(“倍数诱导”)。 [0114] 图58A-C显示了关于多种细胞类型中的多种途径的OgLuc变体9B8和L27V裂解性报告子构建体的发光。 [0115] 图59A-C显示了在不同的细胞系中且利用不同的应答元件OgLuc变体L27V报告子构建体的发光。 [0116] 图60A-B显示了与具有CMV启动子(图60A)或NFkB应答元件(图60B)的细长长腹水蚤(Metridia 1nga)突光素酶相比较OgLuc变体L27V可分泌报告子的发光。 [0117] 图61A-F显示了与HeLa细胞中表达的L27V(L27V00)相比较，L27V的优化的形式(L27V01、L27V02和L27V03)的绝对发光(图61A和61B)、标准化的发光(图61C和61D)和倍数应答(图61E和61F)。 [0118] 图62A-B显 示了用不同剂量的rhTNFa (“TNFa ”)处理的!fepG2细胞中表达的分泌型OgLuc变体L27V02 (含有IL-6分泌信号)报告子(图62A)和L27V02 (“L27V(02) ”)、L27V02P( “L27V(02)P(01) ”)和 luc2 ( “Flue”)报告子的发光。 [0119] 图63显示了与利用天然腔肠素作为底物含分泌信号序列或不含分泌信号序列的hRL(“海肾属”)相比较利用新型PB1-3939作为底物从表达含分泌信号序列或不含分泌信号序列的密码子优化的变体IVopt的HEK293细胞的培养基和裂解物样品中生成的发光。 [0120] 图64A-D显示了在CHO细胞(图64A和64B)和HeLa细胞(图64C和64D)中表达的分泌型OgLuc变体9B8、V2和L27V报告子的发光。 [0121] 图65A-B显示了利用PB1-3939作为底物从分泌型OgLuc变体9B8和V2产生的发光与利用Ready-to-Glow™作为底物细长长腹水蚤的分泌型荧光素酶的发光数字上(图65A)和图表上(图65B)的比较。 [0122] 图66A-B显示了利用腔肠素衍生物ENDUREN™(图66A)和VIVIREN™(图66B)和新型腔肠素PBI_3939(图66B)作为底物从表达hRL( “Ren”)和9B8opt的HEK293细胞生成的高于背景的发光的倍数增加。 [0123] 图67A-D显示了瞬时表达L27V-Ha丨oTag'K:融合体(图67A)或IL6-L27V融合体(图67B-D)的U20S细胞的共聚焦图像。比例尺=20 μ m。 [0124] 图68显示了利用天然腔肠素作为底物在三明治背景存在(“Sand”)或不存在(pF4Ag)下从裂解的表达不同的OgLuc变体和hRL(“海肾属”)的细菌细胞中生成的发光。 [0125] 图69显示了利用天然腔肠素作为底物由于三明治背景的存在导致不同的OgLuc变体和hRL( “海肾属”)的活性的倍数降低。 [0126] 图70显示了利用新型腔肠素PB1-3939作为底物由于三明治背景的存在导致细菌裂解物中9B8opt和9B8opt+K33N的活性的倍数降低。 [0127] 图71显示了 OgLuc变体L27V的光谱轮廓图。 [0128] 图72显示了在无接头或具有5个、10个或20个氨基酸的接头时OgLuc变体L27V、CP84和CP95的两个循环交换`的(CP)形式的发光。 [0129] 图73A-G显示了麦胚抽提物(图73A-D)、大肠杆菌(图73F-G)和HEK293细胞(图73H)中表达的不同的CP-TEV蛋白酶L27V构建体的发光。图73A-D显示了在TEV添加之前不同的CP-TEV蛋白酶L27V构建体的基底发光。图73E显示了图73A-D的CP-TEV蛋白酶L27V构建体的应答。 [0130] 图74显示了不同的蛋白质互补L27V对的倍数应答。 [0131] 图75A-C显示了不同的蛋白质互补(PCA)L27V对的发光，所述蛋白质互补L27V对即:利用1/4构型(图75A)或2/3构型(图75B)将每对的一个L27V片段与FKBP或FRB融合，和HEK293细胞中所监测的FKBP和FRB的相互作用。还监测了不同的蛋白质互补(PCA)阴性对照的发光(图75C)。 [0132] 图76A-H显示了不同的蛋白质互补(PCA) L27V对的发光，所述蛋白质互补L27V对即:利用2/3构型(图76A和76C)或1/4构型(图76B和76D)将每对的一个L27V片段与FKBP或FRB融合，和麦胚抽提物(图76A和76B)和兔网织红细胞裂解物(RRL)(图76C和76D)中所监测的FKBP和FRB的相互作用。在无细胞系统中还测量了不同的蛋白质互补(PCA)阴性对照的发光(图76E)。1/4构型用于无细胞系统(图76F)、HEK293细胞(图76G)和裂解系统(图76H)中。 [0133] 图77A-C显示了用FK506和雷帕霉素(图77A)处理的不同的蛋白质互补L27V对的发光，以及FK506(图77A)和雷帕霉素(图77B)的化学结构。 [0134] 图78显示了利用毛喉素处理OgLuc变体9B8cAMP生物感受器的活性。 [0135] 图79A-D显示了兔网织红细胞裂解物(图79A-B)和HEK293细胞(图79C-D)中循环交换的(图79A和79C)和直接分裂的(图79B和79D)L27V变体的发光。 [0136] 图80A-B显示了 U20S细胞中的OgLuc变体L27V (图80A)和对照载体pGEM3ZF (图80B)关于不同的暴露时间的亚细胞分布。 [0137] 图81A-C显示了与未融合的L27V对照(图81A)相比较，与转录因子Nrf2 (图81B)或GPCR(图81C)融合的OgLuc变体L27V的亚细胞定位。 [0138] 图82A-C显示了利用PBI_43770gLuc变体9B8opt用来监测细胞内信号途径的用途(图82A)。9B8opt荧光素酶与IkB (图82B)或ODD (Hif-1 α的氧依赖的降解结构域)(图82C)融合，并通过发光监测对于刺激物(对于IkB为TNF α，和对于ODD为菲咯啉)的 倍数应答。 [0139] 图83A-C显示了使用OgLuc变体(图83Α)、L27V02 (图83Β)或海肾属荧光素酶(Rluc)(图83C)监测氧化性应激信号途径。 [0140]图 84Α-Β 显示了 Nrf2-L27V02 感受器(图 84A)和 Nrf 2 (ARE) _Luc2P 报告子(图84B)的比较。 [0141] 图85A-B显示了利用ΙμΜ TMR(图85Α)或10 μ M罗丹明110 (图85Β)作为ΗΤ7的配体和利用腔肠素_h作为IV的底物，在具有配体和没有配体的情况下IV-HT7的发射光 -1'TfeP曰。 [0142] 图86显示了利用前腔肠素底物从与半胱天冬酶-3混合(“+半胱天冬酶”)或未与半胱天冬酶-3混合( “无半胱天冬酶”)的裂解的表达9B8opt的细菌细胞中生成的发光。 [0143] 图87A-C显示了利用PB1-3939作为底物在用雷帕霉素处理(图87B)或未用雷帕霉素处理(未示出)时从循环交换的、直接分裂的L27V变体CP84和CP103中生成的发光，和由于雷帕霉素处理导致的应答(图87C)。循环交换的直接分裂的变体的概念显示于图87A 中。 [0144] 图88显示了在暴露于不同的量的尿素后L27V变体的剩余活性百分比。 [0145] 图89显示了 3M尿素对L27V变体的活性的作用。 [0146] 图90A-B显示了利用PB1-3939底物激素诱导的OgLuc融合体的细胞核受体(NR)转位的生物发光成像。 [0147] 图9IA-B显示了利用PB1-3939底物佛波酯诱导的OgLuc融合体的蛋白激酶Ca (PKCa)转位的生物发光成像。 [0148] 图92A-B显示了利用PB1-3939底物OgLuc融合体的自噬体蛋白转位的生物发光成像。 [0149] 详述 [0150] 在详细地解释本发明的任何实施方案之前，应理解地是本发明不限于其关于以下描述中所列的或以下附图中所示出的组分的结构、合成和排列的应用。本发明关于特定的实施方案和技术来描述，然而，本发明可能有另外的实施方案和可能以不同的方式来实践或来进行。 [0151] 除非另外说明，在本发明的方法的以下描述中，流程步骤在室温(约22°C)和大气压力下进行。还应特别理解地是本文所列的任何数字范围包括从下限值到上限值的所有值。例如，若指明浓度范围或有益效果范围为1%到50%，其意为在本说明书中清楚地列举了诸如2%到40%、10%到30%、或1%到3%等。类似地，若给定序列同一性范围为，例如60%到〈100%之间，其意为在本说明书中清楚地列举了诸如65%、75%、85%、90%、95%等。这些仅为具体所指为何的例子，且认为本说明书中清楚地指明了从最低值到最高值的所有可能的数值。 [0152] 除非另外清楚地说明，本申请的文中的术语“包括”意在指出除通过“包括”所引出的列表的成员之外可任选地存在另外的成员。然而，考虑术语“包括”涵盖不存在另外的成员的可能性为本发明的特定的实施方案，即，该实施方案的目的为将“包括”理解为具有“由……组成”的含义。 [0153] 以下的详细描述公开了本发明的单独的特征的特定的和/或优选的变化形式。本发明还考虑了作为特别优选的实施方案，那些实施方案通过将关于本发明的特征中的两个或多个所描述的特定的和/或优选的变化形式中的两个或多个组合而生成。 [0154] 除非另外清楚地说明，本申请中的相对量的所有指示以重量/重量为基础来生成。由通用术语来表征的组分的相对量的指示意在指由所述通用术语所包含的所有特定的变化形式或成员的总数量。若指明由通用术语所定义的某组分以某相对量存在，且若该组分还被表征为由该通用术语所包含的特定的变化形式或成员，其意为另外不存在该通用术语所包含的另外的变化形式或成员，从而该通用术语所包含的组分的总相对量超过了指明的相对量。更优选地，通用术语所包含的另外的变化形式或成员完全不存在。 [0155] 综述 [0156] 在不同的方面，本发明关于新型化合物、新型荧光素酶和其组合。本发明涵盖包括所述新型化合物、新型荧光素酶和/或其组合的方法、组合物和试剂盒。 [0157] 所述新型化合物是新型腔肠素，其可用作利用腔肠素来产生发光的蛋白的底物，所述蛋白包括，但不限于，在不同`的海洋生物中发现的荧光素酶和发光蛋白诸如刺胞动物荧光素酶(例如，海肾属荧光素酶)、水母荧光素酶(例如，来自多管水母(Aequoreajellyfish)的水母发光蛋白)荧光素酶和十足类荧光素酶(例如，细角刺虾的荧光素酶复合物)。在不同的实施方案中，本发明的新型腔肠素相对于天然腔肠素具有增强的物理稳定性(例如，增强的腔肠素稳定性)、降低的自发光和增高的与细胞的生物相容性(例如，对细胞更少的毒性，包括异源的细胞类型)中的至少一项。 [0158] 本文所公开的新型荧光素酶包括十足类荧光素酶的活性亚基的变体。新型荧光素酶可利用不同的腔肠素作为底物，包括，但不限于，天然的和已知的腔肠素以及本发明的新型腔肠素。新型荧光素酶表现出以下中的至少一项:增强的发光(包括增高的亮度、增强的信号稳定性和/或信号持续时间)；增强的酶稳定性(即，增强的酶活性，包括对于升高的温度、PH的改变、抑制剂、变性剂和/或去垢剂的增强的耐受性)；改变的底物特异性(即，相对底物特异性的改变)；和增强的生物相容性(包括增高的细胞中的表达、降低的毒性、和/或细胞压力中的至少一项)。在不同的实施方案中，本发明涵盖新型荧光素酶，所述新型荧光素酶作为可溶的活性单体或与其他分子化学连接(例如，融合蛋白)存在于溶液中，或附着在固体表面上(例如，颗粒、毛细管或检测管或平板)。 [0159] 新型腔肠素和新型荧光素酶的某些组合对生物发光测定提供了显著的技术优点，包括增强的发光、其中增强的发光可由于包括增强的信号稳定性和增强的腔肠素稳定性的一种或多种因素所引起。此外，很多新型腔肠素被设计为小于商购可得的和/或已知的腔肠素。在某些情况下，本发明的新型荧光素酶优选地利用优于商购可得的和/或已知的较大的腔肠素的新型、较小的腔肠素。 [0160] 本发明涵盖以下的组合:新型荧光素酶变体与新型腔肠素；新型荧光素酶变体与已知的或天然腔肠素；和新型腔肠素和使用腔肠素作为底物的任何已知的或天然的蛋白(例如荧光素酶或发光蛋白)。 [0161] 术语“腔肠素”指天然存在的(“天然的”)腔肠素以及其类似物，包括腔肠素-H、腔肠素-f、腔肠素-h、腔肠素-hep、腔肠素_cp、腔肠素-C、腔肠素_e、腔肠素-fcp、双脱氧腔肠素(“腔肠素_hh”)、腔肠素-1、腔肠素-1cp、腔肠素-V、和2-甲基腔肠素，以及W02003/040100和美国申请第12/056，073号([0086]段)中所公开的那些，其公开内容在此通过引用并入。术语“腔肠素”还指本文所公开的新型腔肠素(参见下文)。术语“已知的腔肠素”指在本发明之前已知的腔肠素类似物。 [0162] 术语“OgLuc”指十足类荧光素酶蛋白，或这一蛋白的变体，其在腔肠素的存在下生成光。OgLuc蛋白可能在其天然存在的形式中为单体或可能是蛋白复合物的亚基。本文所公开的示例性的实施方案中所用的OgLuc是来自细角剌虾的荧光素酶复合物的19kDa亚基，但来自其他十足类物种(包括其他剌虾属物种)的类似的多肽也可使用并涵盖于本发明中(参见 R.D.Dennell，Observations on the luminescence of bathypelagicCrustacea decapoda of the Bermuda area,Zool.J.Linn.Soc.，Lond.42(1955)，第393-406 页；还参见 Poupin 等 1999 年 9 月.1nventaire documentedes especies etbilan des formes Ies plus communes de la mer d’Iroise.Rapport Scientifique du Laboratoire d，Oceanographie de IfEcole Navale (LOEN)，Brest (83 页)，其每一项在此 通过引用并入)；例子包括但不限于，以下的荧光素酶:须虾科(Aristeidae)，包括短肢近对虫下(Plesiopenaeus coruscans) ;Pandalidea 科，包括异腕奸属(Heterocarpus)和Parapandalus richardi，管鞭虫下科(Solenoceridae)，包括 Hymenopenaeus debilis 和热带间对虫下(Mesopenaeu s tropicalis);萤奸科(Luciferidae)，包括正型萤虫下(Lucifertypus);樓奸科(Sergestidae)，包括大西洋霞虫下(Sergestes atlanticus)、北极樓虫下(Sergestes arcticus)、尖客页霞虫下(Sergestes armatus)、Sergestes pediformis、Sergestes cornutus、Sergestes edwards1、Sergestes hensen1、梳齿霞虫下(Sergestespectinatus)、Sergestes sargass1、北方霞虫下(Sergestes similis)、Sergestes vigilax、Sergia challenger1、 Sergia grandis、正樓虫下(Sergia lucens)、赤樓虫下(Sergiaprehensilis)、Sergia potens、Sergia robusta、闪烁樓虫下(Sergia scintillans)和 Sergia splendens ;玻璃虫下科(Pasiphaeidae)，包括 Glyphus marsupialis、百慕大细螯虫下(Leptochela bermudensis)、沟额狐玻璃虫下(Parapasiphae sulcatifrons)和 Pasiphea tarda ；剌虫下科(Oplophoridae)，包括 Acanthephyra acanthitelsonis、Acanthephyra acutifrons、Acanthephyra brevirostris、Acanthephyra cucullata、短弯角棘奸(Acanthephyra curtirostris)、异常棘奸(Acanthephyra eximia)、Acanthephyra gracilipes、Acanthephyra kingsley1、Acanthephyra media、Acanthephyra microphthalma、Acanthephyra pelagica、Acanthephyra prionota、紫色剌碟奸(Acanthephyra purpurea)、血红剌碟奸(Acanthephyra sanguinea)、Acanthephyra sibogae、Acanthephyra stylorostratis、Ephyrina bifida、Ephyrina figueirai> Ephyrina koskyni1、扁状扁虫下(Ephyrina ombango)、冷水膜甲虫下(Hymenodora glacialis)、细囊膜虫下(Hymenodora gracilis)、Meningodora miccyla、柔软皮囊奸(Meningodora mollis)、Meningodora vesca、隆脊弓背奸(Notostomusgibbosus)、Notostomus auriculatus、细角刺虫下、Oplophorus grimaldi1、Oplophorusnovaezealandiae> Oplophorus spinicauda、Oplophorus foliaceus、Oplophorusspinosus、典型刺虫下(Oplophorus typus)> Systellaspis brauer1、 Systellaspiscristata、软弱缩甲虫下(Systellaspis debilis)和晶莖腹刺虫下(Systellaspispellucida);和海奸科(Thalassocaridae),包括刺尾拟绿长额奸(Chlorotocoidesspinicauda)、被毛海虫下(Thalassocaris crinita)和 Thalassocaris Iucida0 [0163] SEQ ID NO:1中给出了成熟的(S卩，无信号序列)细角刺虾荧光素酶(S卩，BAB13776的第28位至第196位残基的169个氨基酸)的天然存在形式的19kDa亚基的多肽序列。在不同的实施方案中，在合成的OgLuc序列(例如，若C1+A4E多肽序列SEQ ID NO: 3中所示)的起始插入蛋氨酸残基和缬氨酸残基以协助在异源系统中的克隆和表达。然而，为了一致性，本文所提到的不同的氨基酸置换的位置编号“相对于” SEQ ID NO: 1，S卩，成熟的(无信号序列)、细角刺虾荧光素酶蛋白复合物的天然的19kDa亚基的多肽序列来说明。 [0164] 具体地，若蛋白基于其氨基酸序列与SEQ ID NO:1的比对，序列同一性为>30%，优选地>40%，且最优选地>50%，则为十足类荧光素酶，且该蛋白可利用腔肠素作为底物以催化发光的发射，且起始于对应于SEQ ID NO:1的第8位的位置的氨基酸序列为: [0165] [GSAIVK]-{FE}-[FYW]-χ-[LIVMFSYQ]-χ-χ-{K}-χ-[NHGK]-χ-[DE]-χ-[LIVMFY]-[LIVMWF]-x-{G}-[LIVMAKRG](SEQ ID N0.330)(VII), [0166] 具有不超过5个差异，或更优选地不超过4个、3个、2个或I个差异，或最优选地无差异，其中所述差异发生在对应于根据表4的式(VII)的模式位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17或18的位置中。差异还可包`括表4的模式位置之间的空位或插入。 [0167] 术语“变体”指起始多肽或多核苷酸序列的修饰的形式。术语“亲代”是相对术语，指由此被修饰的起始序列。亲代序列通称用作由所得的修饰的序列所编码的蛋白的参考，例如，以比较由亲代和修饰的序列所编码的蛋白的活性水平或其他性质。起始序列可以是天然存在的(即，天然的或野生型的)序列。起始序列还可以是从而被进一步修饰的变体序列。当在序列的起始、中间和/或末端置换、缺失和/或添加一个或多个氨基酸(其可以是天然存在的或合成的)时，多肽序列是“修饰的”。当在序列的起始、中间和/或末端置换、缺失和/或添加一个或多个核苷酸但可能会或不会改变序列所编码的氨基酸时，多核苷酸序列是“修饰的”。在一些实施方案中，修饰产生作为特定的OgLuc或OgLuc变体的功能性片段的变体。功能性片段是与全长的亲代序列具有相同的功能活性而少于全长的亲代序列的片段。功能活性是表现发光的能力。在一些实施方案中，修饰产生作为亲代序列的交换序列的变体，比如循环交换序列和包括缺失和/或插入的交换序列。 [0168] 本文所公开的OgLuc变体中的一些已被指定了缩略名以协助讨论。术语“C1+A4E” (也称作“C1A4E”)指相对于SEQ ID NO:1具有氨基酸置换A4E、Q11R、A33K、V441、A54F、P115E、Q124K、Y138I 和 N166R 的 OgLuc 变体(SEQ ID NO:2 和 3)(其中格式“X#y”指被替换为变体氨基酸“y”的第“#”位的亲代氨基酸“X”)。除非另外指明，本文出现的C1+A4E OgLuc变体的变体包含见于C1+A4E的至少氨基酸置换。术语“IVY”指相对于SEQ ID NO:1具有另外的氨基酸置换F541、I90V和F77Y的C1+A4E OgLuc变体的变体(SEQ ID N0:8和9)。术语“IV”指相对于SEQ ID NO:1具有另外的氨基酸置换F54I和I90V的C1+A4E OgLuc变体的另一变体(SEQ ID NO: 14和15)。术语“QC27”指相对于SEQID N0:1具有另外的氨基酸置换Q18L、F541、L92H和Y109F的C1+A4E OgLuc变体的又一个另外的变体(SEQ ID N0:4和5)。术语“QC27_9a”指相对于SEQ ID NO:1具有另外的氨基酸置换 V21L、F68Y、L72Q、M75K、H92R 和 V158F 的 QC270gLuc 变体的变体(SEQ ID NO: 6 和7)。术语“9B8”指相对于SEQ ID NO:1具有另外的氨基酸置换Q18L、F68Y、L72Q和M75K的IV OgLuc变体的变体(SEQ ID NO: 18和19)。术语“9B8opt”指9B8变体的密码子优化的形式(SEQ ID NO: 24) ο术语“9B8opt+K33N”指相对于SEQ ID NO:1具有另外的氨基酸置换 K33N 的 9B8opt 变体的变体(SEQ ID N0:42 和 43)。术语“9B8opt+K33N+170G”指相对于SEQ ID NO:1具有另外的附加于变体的C-末端的甘氨酸，S卩170G的“9B8opt+K33N”变体的变体(SEQ ID N0:68 和 69)。术语 “L27V+T39T+K43R+Y68D” 和 “L27V” 指相对于 SEQ IDNO:1具有另外的氨基酸置换L27V、T39T、K43R和Y68D的“9B8opt+K33N”变体的变体(SEQID N0:88和89)。术语“T39T+K43R+Y68D”和“V2”指相对于SEQ ID NO:1具有另外的氨基酸置换 T39T、K43R 和 Y68D 的 “9B8opt+K33N” 变体的变体(SEQ ID N0:92 和 93)。 [0169] 通称，“增强的”意为相对于参考荧光素酶加腔肠素组合或所讨论的荧光素酶，特定的性质(例如，发光、信号稳定性、生物相容性、蛋白稳定性(例如，酶稳定性)或蛋白表达)增高了，其中所述增高为高于所述参考荧光素酶加腔肠素组合或所讨论的荧光素酶的至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少50%、至少75%、至少90%、至少100%、至少200%、至少500%或至少1000%。 [0170] 术语“发光”指在适当的条件下OgLuc变体的光输出，例如，在适宜的底物诸如腔肠素的存在下。光输出可作为发光反应的起始时的光输出的瞬时或近瞬时测量(有时称作“τ=0”发光或“闪光”)来测量，其可在添加腔肠素底物后开始。在不同的实施方案中，发光反应在溶液中进行。在另外的实施方案中，发光反应在固体载体上进行。溶液可包含裂解物，例如来自原核或真核表达系统中的细胞。在另外的实施方案中，表达发生在无细胞系统，或荧光素酶蛋白分泌到细胞外介质中，从而，在后一情况下，不必产生裂解物。在一些实施方案中，反应通过将适当 的原料例如，腔肠素、缓冲液等注入到包含发光蛋白的反应室(例如，多孔板的孔诸如96孔板)中来起始。在又一些另外的实施方案中，OgLuc变体和/或新型腔肠素被导入到宿主中且在宿主或其部分上进行发光的测量，所述宿主或其部分可包括完整的生物体或其细胞、组织、外植体或提取物。反应室可位于可例如利用光度计或光电倍增器测量光输出的读数装置中。还可随时间推移来测量光输出或发光，例如，在相同的反应室中持续几秒、几分钟、几小时等的时间段。光输出或发光可记录为一段时间的平均值、信号的衰减的半衰期、一段时间的信号的总和或最高输出。发光可以相对光单位(RLU)来测量。 [0171] OgLuc变体的“增强的发光”可由于以下特征中的一种或多种而引起:增强的光输出(即，亮度)、增强的底物特异性、增强的信号稳定性和/或增强的信号持续时间。增强的信号稳定性包括来自荧光素酶的信号持续发光的时间的增加，例如，如通过时间过程中的信号的衰减的半衰期所测量的。增强的发光可相对于与天然的、已知的或新型底物相组合的荧光素酶诸如野生型OgLuc、OgLuc变体蛋白、海肾属荧光素酶(例如，hRluc)或萤火虫突光素酶(例如，来自北美萤火虫(Photinus pyralis)的Luc2突光素酶)的可比较的性质来确定，如以下实施例中所示。例如，利用以下实施例中所公开的测定中的一种或多种，可将与特定的腔肠素(包括天然的、已知的或新型腔肠素)组合的给定的OgLuc变体的发光与同本文所公开的天然的、已知的、或新型腔肠素中的任何组合的OgLuc变体C1+A4E、IV或IVY中的一种的性质相比较。尤其是，可通过测量由含所讨论的OgLuc变体的细菌裂解物与底物PB1-3939的孵育产生的发光信号(RLU)来确定增强的发光。测量在可能包含TERGIT0L™的试剂中进行以提供Glo样动力学，例如，在其中酶失活减缓且发光信号稳定，其在本申请的其他地方被描述。在一些实施方案中，一些荧光素酶变体，例如，L27V，与某些化合物，例如，PB1-3939，提供了发光发射的延长的持续时间，或在不存在TERGIT0L™时出现辉光样动力学。可将发光信号与参考点诸如C1+A4E变体与腔肠素或腔肠素_h或海肾属荧光素酶与天然腔肠素的发光信号相比较。 [0172] “酶稳定性”指酶活性的稳定性(即，酶活性对反应条件的耐受性)。增强的酶稳定性指酶活性的增强的稳定性(即，对反应条件增强的耐受性)。增强的酶稳定性包括增强的热稳定性(例如，在升高的温度下的稳定性)和化学稳定性(例如，在抑制剂或变性剂诸如去垢剂(包括例如TRIT0N™X-100)存在下的稳定性)。尤其在已知破坏蛋白结构的条件下，诸如高温或化学变性剂存在下，酶稳定性可用作蛋白稳定性的量度。尤其是，可利用如本申请中其他地方(例如，在实施例28中)所描述的热分析来确定增强的蛋白稳定性。可将发光信号与C1+A4E变体和腔肠素或腔肠素_h或海肾属荧光素酶和天然腔肠素的参考点相比较。 [0173] “生物相容性”指细胞(例如，原核的或真核的)对荧光素酶和/或腔肠素化合物的耐受性。荧光素酶和/或腔肠素的生物相容性与其在宿主细胞上导致的应激有关。例如，细胞不耐受的荧光素酶可能不会在细胞中有效地表达，例如，该荧光素酶可能在细胞中表达，但由于所表达的蛋白的包涵体的形成导致表现出降低的活性。荧光素酶的生物相容性与细胞对外源基因的插入的耐受的能力相关，所述外源基因即，包含编码荧光素酶或其片段的基因的转基因，借此具有转基因的细胞不会表现出应激的表现，所述应激的表现包括应激反应途径的诱导、降低的生长`速率和/或降低的生存力(例如，降低的活细胞的数目、降低的膜完整性或增高的凋亡速率)。细胞应激的其他指示可包括基因表达、信号途径和/或调控途径的改变。OgLuc变体的增强的生物相容性可由于诸如增强的蛋白表达和/或降低的细胞应激的因素所导致。关于编码OgLuc变体的特定的多核苷酸的增强的发光的表达可相对于编码野生型OgLuc或OgLuc变体蛋白的多核苷酸(包括密码子优化的多核苷酸)的发光表达水平来确定，其中可将发光活性用作监测蛋白表达水平的工具。 [0174] 尤其是，OgLuc变体、新型腔肠素化合物和/或其组合的增强的生物相容性可通过测量细胞生存力和/或细胞的生长速度来确定。例如，OgLuc变体的增强的生物相容性可通过在不存在任何腔肠素化合物的情况下测量与包含萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶或不包含荧光素酶的细胞相比较的包含OgLuc变体的细胞生存力和/或细胞的生长速率以确定该荧光素酶对细胞的相容和/或毒性的程度来确定。新型腔肠素化合物的增强的生物相容性可通过在不存在细胞的荧光素酶表达的情况下测量与天然的或已知的腔肠素相比较暴露于新型腔肠素化合物的细胞生存力以确定腔肠素化合物对细胞的相容性和/或毒性的程度来确定。OgLuc变体与新型腔肠素化合物的组合的增强的生物相容性可通过测量包含OgLuc变体并暴露于新型腔肠素和包含萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶或不含荧光素酶且暴露于天然的或已知的腔肠素的细胞相比较的细胞生存力和/或细胞的生长速度来确定。 [0175] 尤其是，增强的生物相容性可利用如本申请中的其他地方所描述的细胞生存力分析(例如，利用如实施例18中所描述的CELLTITER-GLO®测定或诸如根据制造商的说明利用CASPASE-.GLO®技术的凋亡测定)或本领域中已知的分析来确定。OgLuc变体对细胞生存力或凋亡的作用可与参考荧光素酶诸如C1+A4E变体、萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶的作用相比较。新型腔肠素化合物对细胞生存力或凋亡的作用可与天然的或已知的腔肠素化合物对细胞生存力或凋亡的作用相比较。 [0176] 增强的生物相容性可通过测量OgLuc变体和/或新型腔肠素化合物对细胞生长或基因表达的作用来确定。例如，OgLuc变体的增强的生物相容性可通过在一段时间后测量细胞数目来确定或通过确定包含OgLuc变体的细胞的样品中的应激反应基因的表达与包含另一荧光素酶或不含荧光素酶的细胞相比较来确定。新型腔肠素化合物的增强的生物相容性可通过在一段时间后测量细胞数目来确定或通过测定暴露于新型腔肠素化合物的细胞的样品中的应激反应基因的表达与暴露于天然的或已知的腔肠素或不暴露于腔肠素的细胞相比较来确定。OgLuc变体对细胞生长或基因表达的作用可与参考荧光素酶，诸如C1+A4E变体、萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶相比较。新型腔肠素对细胞生长或基因表达的作用可与天然的或已知的腔肠素相比较。 [0177] 荧光素酶的明亮的信号和OgLuc基因的小尺寸可有利于鉴定表达本发明的细胞质形式或分泌形式的OgLuc变体的稳固的、稳定的细胞系。预期相对小的基因序列将降低由外源DNA整合到细胞基因组中产生的基因不稳定性的可能性。与其他已知荧光素酶诸如天然的OgLuc、萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶相比较，由于本发明的OgLuc变体和/或新型腔肠素的增大的亮度、更少的蛋白表达和从而转染所需的更少的DNA可产生既定水平的亮度，其有助于OgLuc变体和/或新型腔肠素的增强的生物相容性。OgLuc变体的增强的生物相容性可通过瞬时转染中生成具有与利用其它荧光素酶例如天然的OgLuc、萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶 所转染的细胞相同水平的发光的细胞所需的DNA或试剂的量来测量，所述试剂例如转染化学物质。在一些实施方案中，用于转染以生成具有与利用其它荧光素酶获得的发光相同的水平的转染的细胞所需的OgLuc变体DNA或试剂的量小于另一荧光素酶例如天然的OgLuc、萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶所需的量。OgLuc变体的增强的生物相容性可通过转染后细胞的恢复时间来测量。在一些实施方案中，在利用OgLuc变体转染后的恢复所需的时间的量小于另一荧光素酶例如天然的OgLuc、萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶所需的时间。 [0178] “相对底物特异性”是通过检验腔肠素底物存在下荧光素酶的发光除以参考腔肠素存在下荧光素酶的发光来确定的。例如，相对特异性可通过利用本发明的新型腔肠素的荧光素酶的发光除以利用不同的腔肠素(例如，天然的或已知的腔肠素，关于例子参见图1，或本发明的不同的新型腔肠素)的荧光素酶的发光来确定的。检验腔肠素底物和所比较的参考腔肠素底物被认为是用于确定相对底物特异性的比较底物对。 [0179] “相对底物特异性的改变”通过利用比较底物对的检验荧光素酶的相对底物特异性除以利用相同的比较底物对的参考荧光素酶的相对底物特异性来确定。例如，相对特异性的改变可通过与不同的腔肠素(例如，天然的或已知的腔肠素或本发明的不同的新型腔肠素)相比较利用本发明的新型腔肠素的检验荧光素酶的相对底物特异性除以与用于检验荧光素酶的相同的不同的腔肠素相比较利用本发明的新型腔肠素的参考荧光素酶的相对底物特异性。 [0180] 在一些实施方案中，利用一种新型腔肠素的发光与利用不同的新型腔肠素的发光相比较。在一些实施方案中，利用一种天然的或已知的腔肠素的发光与利用另一天然的或已知的腔肠素的发光相比较。在又一些另外的实施方案中，利用一种天然的或已知的腔肠素的发光与利用新型腔肠素的发光相比较。 [0181] 本发明的新型腔肠素包括诸如增强的物理稳定性(例如，增强的腔肠素稳定性)或降低的自发光的性质。腔肠素的物理稳定性指在某些条件下腔肠素的稳定程度使得当用作荧光素酶的底物时其维持发光的能力。不依赖于荧光素酶或发光蛋白的活性的发光称作自发光。自发光是衰变或分解过程中通过以光的形式释放的能量产生的物质的发光。例如，自发光可由于激活发光的底物腔肠素的自发氧化而导致。 [0182] 如本文所用的，“纯的”或“纯化的”意为对象物质是所存在的主要物质(即，以摩尔和/或质量为基础，除组合物中的含水系统的水、溶剂、缓冲液或其他常见组分外，其比任何其他单独的物质更丰富)，和，在一些实施方案中，纯化的级分是其中对象物质占所存在的所有大分子物质的至少约50%(以摩尔为基础)的组合物。通常，“基本上纯的”组合物将占组合物中存在的所有其他大分子物质的约80%以上，在一些实施方案中，约85%以上、约90%以上、约95%以上或约99%以上。在一些实施方案中，对象物质被纯化至基本上均质性(组合物中的杂质物质不能通过常规检测方法检测到)，其中组合物基本上由单一的大分子物质所组成。 [0183] 腔肠素衍生物 [0184] 在一些实施 方案中，本发明提供了式(Ia)或(Ib)的新型腔肠素衍生物: [0185] R2 0H A Ji M I I I I N R8 I LJ I Π K (Ia) [0186]或 [0187] [0188] 其中R2选自由以下组成的组: 或C2-5 直 链烷基； [0190] R6 选自由-H、-OH、-NH2、-OC (O) R 或-OCH2OC (O) R 组成的组； R3 [0191] R8选自由 H或低级环烷基组成的组； [0192] 其中R3和R4均为H或均为CV2烷基； [0193] W 为-NH2、卤代、-OH、-NHC (O) R、-CO2R ； [0194] X 为-S-、-O-或-NR22-； [0195] Y 为-H、-OH 或-OR11 ; [0196] Z 为-CH 或-N-; [0197]每个R11 独立地为-C (O) R，’ 或-CH2OC (O) R，’ ； [0198] R22 为 H、CH3 或 CH2CH3 ; [0199] 每个R独立地为Cu直链烷基或Cu支链烷基； [0200] R’ ’为CV7直链烷基或CV7支链烷基； [0201] 虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的； [0202]前提条件是当R2为 时，R8不为 [0203] 前提条件是当R2为 时，R8是 或低级环烷基；和 [0204] 前提条件是当R6为NH2时，R2为 或C2-5烷基; [0205]或 R8 不为 [0206] 如本文所用的，术语“烷基”属于通过从烃化合物中取出氢原子而获得的单价部分，且其可以是饱和的，部分不饱和的或完全不饱和的。烷基可以是直链的或支链的。烷基可以任选地被例如卤代所取代。直链烷基的例子包括，但不限于，乙基、正-丙基、正-丁基和正-丙基、正-己基和正-庚基。具有一个或多个碳-碳双键的不饱和的烷基的例子包括，但不限于，乙烯基(乙烯基，-CH=CH2)、2_丙烯基(烯丙基，-CH-CH=CH2)，和丁烯基。具有一个或多个碳-碳三键的不饱和的烷基的例子包括，但不限于，乙炔基和2-丙炔基(炔丙基)。支链烧基的例子包括异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基和异戍基。 [0207] 如本文所用的，术语“低级环烷基”属于通过从具有3至5个碳原子的烃化合物中去除氢原子而获得的单价部分。饱和的低级环烷基的例子包括，但不限于，基团诸如环丙基、环丁基和环戊基。具有一个或多个碳-碳双键的不饱和的低级环烷基的例子包括，但不限于，基团诸如环丙烯基、环丁烯基和环戊烯基。 [0208] 如本文所用的，术语“卤代”属于卤素，诸如Cl、F、Br或I。 [0209] 在一些实施方案中，R2是 且X是O或S。在另外的实施方案 中，R2是C2_5直链烷基。在某些实施方案中，R8是 低级环烷基或H。在另外 的实施方案中，R8是苯甲基。在一些实施方案中，R”是-C(CH3)3' -CH(CH3)2' -CH2C(CH3)3或-CH2CH (CH3)2。 [0210] 在一些实施方案中，本发明提供了根据式(IIa)或(IIb)的化合物: [0211] [0214] 其中X是0或S，R6是H或0H，R11如以上所定义，且虚线的键表示任选的环的存在。 [0215] 在一些实施方案，本发明提供了式(IIIa)或(IIIb)的化合物: [0216] [0217]或 [0218] [0219] 其中R12是C2_5直链烷基、呋喃基或噻吩基，R6是H或0H，R11如以上所定义，且虚线的键表示任选的环的存在。 [0220] 在一些实施方案中，本发明提供了式(IVa)或(IVb)的化合物: [0221] [0224] 其中X是0或S，R6是H或0H，R8是Η、 或低级环烷基，R3、 R4和Rn如以上所定义，且虚线的键表示任选的环的存在。 [0225] 在一些实施方案中，本发明提供了根据式(Va)或(Vb)的化合物: [0226] [0229] 其中R8是苯甲基，R11如以上所定义，且虚线的键表示任选的环的存在。 [0230] 在一些实施方案中，本发明提供了式(VIa)或(VIb)的新型腔肠素衍生物: [0231] [0232]或 [0233] [0234]其中R2 选自由 或C2_5直链烧基组成的组； [0235] R6 选自由-H、-OH、-NH2、-OC (O) R 或-OCH2OC (O) R 组成的组； [0236] R8选自由以下组成的组: [0237] H或低级环烷基； [0238] 其中R3和R4均为H或均为CV2烷基； [0239] W 为-NH2、卤代、-OH、-NHC (O) R、-CO2R ； [0240] X 为-S-、-O-或-NH-； [0241] Y 为-H、-OH 或-OR11 ; [0242] Z 为-CH 或-N-； [0243]每个 R11 独立地为-C (O) R，’ 或-CH2OC (O) R，’ ； [0244] 每个R独立地为Cu直链烷基或Cu支链烷基； [0245] R’ ’为CV7直链烷基或CV7支链烷基； [0246] 虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的； [0247]前提条件是当R2 为 或 时，R8不为 [0248] 前提条件是当R2为 时，R8是或低级环烷基；和 [0249]如提条件是当R6为NH2时，R2为 或C2_5焼基； .[0250] 或R8不为 [0251] 根据本发明的适宜的化合物包括 [0252] [0253] 异构体、盐和受保护的形式 [0254] 某些化合物可以一种或多种特定的几何的、光学的、对映异构的、非对映异构的、差向异构的、立体异构的、互变异构的、构象的或异头的形式存在，包括但不限于，顺式和反式；E型和Z型；c型、t型和r型；内向型和外向型；R型、S型和内消旋型；D型和L型；(!型和I型；(+)型和(-)型；酮式、烯醇式和烯醇式；顺式和反式；向斜形式和背斜形式；α形式和β形式；轴向形式和平伏形式；船式、椅式、扭式、信封式和半椅式；和其组合，下文总称为“异构体”(或“异构形式”)。 [0255] 注意，除以下关于互变异构形式所讨论的，特别排除在如本文所用的术语“异构体”之外的，为结构(或构造)异构体(即，原子之间的连接不同而非仅原子的空间位置不同的异构体)。例如，提及甲氧基，-OCH3，不应被解释为提及其结构异构体，羟甲基，-CH20H。相似地，提及邻氯苯基，不应被解释为提及其结构异构体，间氯苯基。然而，提及一类结构可完全包括属于该类的结构上的异构形式(例如，CV7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧苯基包括邻甲氧苯基、间甲氧苯基和对甲氧苯基)。 [0256] 注意，特别包括在术语“异构体”中的是具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1I2H(D)和3H(T);(:可以是任何同位素形式，包括12C、13C和14C ;0可以是任何 同位素形式，包括16O和18O ;和诸如此类。 [0257] 除非另外说明，提及特定的化合物包括所有这样的异构形式，包括(全部地或部分地)其外消旋体和其他混合物。用于制备(例如不对称合成)和分离(例如分步结晶和色谱方法)这样的异构形式的方法是本领域中已知的或通过以已知的方式改变本文所教导的方法或已知方法易于获得的。 [0258] 除非另外说明，提及特定的化合物还包括其离子、盐、溶剂合物和受保护的形式，例如，如以下所讨论的。制备、纯化和/或操作活性化合物的对应的盐可以是方便的或理想的，例如，药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的例子在Berge等，J.Pharm.Sc1.,66:1-19(1977)中被讨论。 [0259] 例如，若化合物是阴离子的，或具有可为阴离子的官能团(例如，-COOH可以为-C00-)，则可利用适宜的阳离子来形成盐。适宜的无机阳离子的例子包括，但不限于，碱金属离子诸如Na+和K+、碱土阳离子诸如Ca2+和Mg2+，和其他阴离子诸如Al3+。适宜的有机阳离子的例子包括，但不限于，铵离子(即，NH4+)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2+、NHR3+、NR4+)。一些适宜的取代的铵离子的例子是来源于以下的那些:乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苄基苯胺、胆碱、葡甲胺和氨基丁三醇，以及氨基酸，诸如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵的例子是N(CH3) 4+。 [0260] 若化合物是阳离子的，或具有可以为阳离子的官能团(例如，-NH2可以为-NH3+)，则可利用适宜的阴离子形成盐。适宜的无机阴离子的例子包括，但不限于，来源于以下的无机酸的那些:盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。适宜的有机阴离子的例子包括，但不限于，来源于以下有机酸的那些:醋酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、硬脂酸、棕榈酸、乳酸、苹果酸、双羟萘酸、酒石酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、肉桂酸、丙酮酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、乙烷二磺酸、草酸、泛酸、羟乙磺酸、戊酸、乳糖酸和葡萄糖酸。适宜的聚合物阴离子的例子包括，但不限于，来自于以下的聚合酸的那些:单宁酸、羧甲基纤维素。 [0261] 制备、纯化和/或操作活性化合物的对应的盐可能是方便的或理想的。如本文所用的术语“溶剂合物”在其一般含义中指溶质(例如，活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。若溶剂是水，则溶剂可以被合宜地称作水合物，例如，一水合物、二水合物、三水合物等。 [0262] 制备、纯化和操作化学保护形式的活性化合物可以是方便的或理想的。如本文所用的术语“化学保护形式”属于其中一个或多个反应性官能团被保护免于不希望的化学反应的化合物，即，为保护基团(也称作掩蔽基团或封闭基团)。通过保护反应性官能团，可进行涉及其他非保护的反应性官能团的反应，而不影响保护基团；通常可在随后的步骤中将保护基团去除，而基本上不影响分子其余的部分。参见，例如，Protective Groups inOrganic Synthesis (T.Green 和 P.ffuts, Wiley, 1999)。 [0263] 例如，羟基可以是受保护的，作为醚(-0R)或酯(_0C(=0)R)，例如，作为:叔丁基醚；苄醚、二苯甲基(二苯基甲基)醚或三苯甲基(三苯基甲基)醚；三甲基硅醚或叔丁基甲基硅基醚；或乙酰酯(_0C(=0)CH3，-OAc)。例如，醛基或酮基可分别作为缩醛或缩酮来被保护，其中通过与例如伯醇反应将羰基(>C=0)转化为二醚OC(OR)2)。醛基或酮基易于在酸的存在下通过利用过量的水进行水解而再生。例如，胺基可作为例如酰胺或氨基甲酸乙酯来被保护，例如，作为:甲基酰胺(-NHCO-CH3);苄氧基酰胺(-NHCO-OCH2C6H5, -NHCbz)；作为叔丁氧基酸胺(-NHC0-0C (CH3) 3，-NH-Boc) ; 2-联苯基-2-丙氧基酸胺(-NHC0-0C(CH3)2C6H4C6H5，-ΝΗ-Bpoc)，作为9-芴基甲氧基酰胺(-NH-Fmoc)，作为6-硝基藜芦基氧基酰胺(-NH-Nvoc)，作为2-三甲基硅乙氧基酰胺(-ΝΗ-Teoc)，作为2，2，2-三氯乙氧基酰胺(-ΝΗ-Troc)，作为烯丙氧基酰胺(-NH-Alloc)，作为2-(苯基磺酰基)乙氧基酰胺(-ΝΗ-Psec);或，在适宜的情况下，作为N-氧化物。 [0264] 例如，羧酸基团可被保护作为酯，例如，作为:(；_7烷基酯(例如，甲基酯；叔丁基酯);(V7齒代烷基酯(例如，C1-7三齒代烷基酯);三C1-7烷基硅烷基-Ch烷基酯；或C5_2Q芳基-Cw烷基酯(例如，苄基酯；硝基苄基酯)；或作为酰胺，例如，作为甲基酰胺。 [0265] 例如，硫醇基可被保护作为硫醚(-SR)，例如，作为:苄基硫醚；乙酰胺基甲基醚(-S-CH2NHC (=0) CH3) ο [0266] 腔肠素衍生物的合成 [0267] 根据本发明的腔肠素衍生物可根据实施例1-16中所详细描述的那些方法来合成。 [0268] 突变体刺虾属荧光素酶 [0269] 在本发明的实施方案中，使用了本文所描述的多种技术来鉴定氨基酸置换的位点以产生改良的合成的OgLuc多肽。使用了另外的技术以优化编码不同的多肽的多核苷酸的密码子以增强多肽的表达。据发现作出一个或多个单独的或不同的组合的氨基酸置换，产生了具有增强的发光(例如，增强的亮度、增强的信号稳定性、增强的酶稳定性和/或相对底物特异性的改变)的合成的OgLuc型多肽。此外，编码不同的合成的OgLuc变体多肽的多核苷酸中包括一个或多个密码子优化的置换在不同的真核和原核表达系统中产生了多肽的增强的表达。本发明的一个实施方案是编码合成的OgLuc变体多肽的多核苷酸，当所述OgLuc变体多肽在原核和/或真核细胞中表达时为可溶的且在单体形式时是活性的。 [0270] 本发明的OgLuc变体可与感兴趣的任何蛋白或感兴趣的分子相偶联。在一些实施 方案中，变体是融合蛋白，例如，一些变体与附着在N-末端或C-末端的丨hiloTag®多肽偶联。除非另外注明，作为HaloTag⑩融合体的变体包括“HT7”作为其名称的部分，例如，“IVY-HT7”。在一些实施方案中，信号序列(例如，天然存在的细角刺虾属信号序列)附着到融合蛋白的N-末端以协助融合蛋白从细胞中分泌。信号序列，而非OgLuc荧光素酶天然存在的信号序列，是本领域中已知的以协助哺乳动物细胞或其他细胞类型中的蛋白分泌。信号序列与膜锚定序列组合可用于使OgLuc变体在细胞膜的外部表面上定位或显示。本领域中已知的其他方法也可用于将OgLuc变体定位于膜或细胞中的其他位置。 [0271] 在一些实施方案中，本发明提供了修饰的十足类荧光素酶，其相对于对应的亲代变体十足类荧光素酶具有增强的发光。例如，亲代的变体OgLuc是C1+A4E、IVY、IV、QC27、QC27-9a、9B8、9B8opt+K33N、9B8opt+K33N+170G、V2 或 “L27V”。在另一个实施方案中，本发明提供了利用新型腔肠素的修饰的十足类荧光素酶。在一个实施方案中，修饰的十足类荧光素酶对于天然的、已知的或新型腔肠素具有相对特异性的改变。在一个实施方案中，修饰的十足类荧光素酶相对于对应的亲代的变体十足类荧光素酶具有相对特异性改变。 [0272] 在一些实施方案中，对应的亲代的变体十足类荧光素酶是十足类物种，包括来自十足目的科的不同的物种，包括，但不限于，以下的荧光素酶:须虾科(Aristeidae)，包括短肢近对奸(Plesiopenaeus coruscans) ;Pandalidea 科，包括异腕奸属(Heterocarpus)和 Parapandalus richardi，管鞭虫下科(Solenoceridae)，包括 Hymenopenaeus debilis 和热带间对奸(Mesopenaeus tropicalis);萤奸科(Luciferidae)，包括正型萤奸(Lucifertypus);樓奸科(Sergestidae)，包括大西洋霞虫下(Sergestes atlanticus)、北极樓虫下(Sergestes arcticus)、尖客页霞虫下(Sergestes armatus)、Sergestes pediformis、Sergestes cornutus、Sergestes edwards1、Sergestes hensen1、梳齿霞虫下(Sergestespectinatus)、Sergestes sargass1、北方霞虫下(Sergestes similis)、Sergestes vigilax、Sergia challenger1、 Sergia grandis、正樓虫下(Sergia lucens)、赤樓虫下(Sergiaprehensilis)、Sergia potens、Sergia robusta、闪烁樓虫下(Sergia scintillans)和 Sergia splendens ;玻璃虫下科(Pasiphaeidae)，包括 Glyphus marsupialis、百慕大细螯虫下(Leptochela bermudensis)、沟额狐玻璃虫下(Parapasiphae sulcatifrons)和 Pasiphea tarda ；剌虫下科(Oplophoridae)，包括 Acanthephyra acanthitelsonis、Acanthephyra acutifrons、Acanthephyra brevirostris、Acanthephyra cucullata、短弯角棘奸(Acanthephyra curtirostris)、异常棘奸(Acanthephyra eximia)、Acanthephyra gracilipes、Acanthephyra kingsley1、Acanthephyra media、 Acanthephyra microphthalma、Acanthephyra pelagica、Acanthephyra prionota、紫色剌碟奸(Acanthephyra purpurea)、血红剌碟奸(Acanthephyra sanguinea)、Acanthephyra sibogae、 Acanthephyra stylorostratis、 Ephyrina bifida、Ephyrina figueira1、Ephyrina koskyni1、扁状扁虫下(Ephyrina ombango)、冷水膜甲虫下(Hymenodora glacialis)、细囊膜虫下(Hymenodora gracilis)、Meningodora miccyla、柔软皮囊奸(Meningodora mollis)、Meningodora vesca、隆脊弓背奸(Notostomusgibbosus)、Notostomus auriculatus、细角剌虫下、Oplophorus grimaldi1、OplophorusnovaezealandiaeΛ Oplophorus spinicauda、Oplophorus foliaceus、Oplophorusspinosus、典型剌虫下(Oplophorus typus)、 Systellaspis brauer1、 Systellaspiscristata、软弱缩甲虫下(Systellaspis debilis)和晶莖腹剌虫下(Systellaspispellucida);和海奸科(Thalassocaridae)，包括剌尾拟绿长额奸(Chlorotocoidesspinicauda)、被毛海虫下(Thalassocaris crinita)和 Thalassocaris Iucida0 在一些实施方案中，在原核细胞和/或真核细胞中修饰的荧光素酶相对于对应的野生型荧光素酶具有增高的发光发射，例如，至少1.3倍，至少2倍或至少4倍。在一些实施方案中，将修饰的十足类荧光素酶的一种或多种性质与来自另一物种的荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶或海肾属荧光素酶)的类似的性质相比较。 [0273]在一些实施方案中，OgLuc 变体与 SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、27、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、56、58、60、62、64、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93 或 95 具有至少 60%,例如，至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%或100%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，OgLuc变体或其功能片段，具有不超过5个差异，或更优选地，不超过4个、3个、2个或I个差异，或最优选地无差异，其中所述差异发生在对应于根据表4的式(VII)的模式位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17或18的位置中。差异还可包括表4的模式位置之间的空位或插入。 [0274] 在一些实施方案中，本发明的OgLuc变体在N-末端、C-末端或两端具有一个或多个异源的氨基酸序列(融合多肽诸如具有表位或融合标签的融合多肽)，其任选地与感兴趣的分子直接地或间接地相互作用。在一些实施方案中，在与感兴趣的分子相互作用之前或之后，异源序列的存在基本上不改变OgLuc变体的发光。在一些实施方案中，异源氨基酸序列是表位标签。在一些实施方案中，异源氨基酸序列是这样的，在与感兴趣的分子相互作用期间或之后，经历了构象改变，其进而改变了 OgLuc变体的活性，例如具有这样的氨基酸序列的OgLuc变体对于检测变构相互作用是有用的。OgLuc变体或与OgLuc变体的融合体或其片段可用作报告子。 [0275] 在一些实施方案中， 本发明的OgLuc变体的片段与异源氨基酸序列融合，融合从而形成β_桶，该融合蛋白能够从天然存在的腔肠素或其类似物中生成发光，所述其类似物包括本文所讨论的多种已知的腔肠素，或本发明的新型腔肠素。 [0276] 还提供的是编码本发明的OgLuc变体或其融合体的多核苷酸，具有该多核苷酸或OgLuc变体或其融合体的分离的宿主细胞，和使用本发明的多核苷酸、OgLuc变体或其融合体或宿主细胞的方法。 [0277] 在两种或多种核酸或多肽序列的情况下，术语“同一性”指当利用任何数目的序列比较算法或通过人工比对和直观检查所测量的跨越比较窗口或指定区域关于最大一致性进行比较和比对时，相同的或具有特定的百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或多个系列或子序列。用于比较的序列的比对方法是本领域中熟知的。用于比较的序列的最佳比对可通过以下来进行:Smith 等，(J.Mol.Biol.147:195-197 (1981))的算法，Needleman和 Wunsch, (J.Mol.Biol., 48:443-453 (1970))的同源比对算法，Pearson 和 Lipman, (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 85:2444-2448 (1988))的相似性搜索方法，算法的计算机化的实施，例如，FASTA、SSEARCH、GGSEARCH (可在弗吉尼亚大学Wi 11 iam R.Pearson的FASTA服务器获得http://fasta.bioch.Virginia, edu/fasta_www2/fasta_intr0.shtml), Clustal 系列程序(Chenna 等，Nucl.Acids Res.31 (13): 3497-3500 (2003);可获得的例子在 http://www.eb1.ac.uk或http://www.ch.embnet.0rg),或其他序列分析软件。本领域中已知的是在具有显著的序列改变的多肽序列之间以最大一致性生成比对可能涉及专业的方法的使用，诸如ABA方法(Raphael 等，Genome Res.14(11):2336-2346 (2004))，其他适宜的方法，或利用多肽序列的两个链接的相同的拷贝进行比对。[0278] 如本文所用的术语“核酸分子”、“多核苷酸”或“核酸序列”指核酸，包括DNA或RNA，其包括产生多肽或蛋白前体所需要的编码效率。所编码的多肽可以是全长的多肽、其片段(小于全长)，或全长的多肽或其片段与另一多肽的融合体，产生的融合多肽。 [0279] 编码蛋白或多肽的多核苷酸意为包括基因的编码区域的核酸序列，或换言之，编码基因产物的核酸序列。编码区域可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可以是单链的(例如，有义链)或双链的。若需要，适宜的控制元件诸如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等可位于邻近基因的编码区域以允许初级RNA转录物的转录和/或正确的加工的恰当起始。其他控制或调控元件包括，但不限于，转录因子结合位点、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号和增强子元件。 [0280] “肽”、“蛋白”和“多肽”意为不同的长度的氨基酸链，而无论翻译后修饰如何(例如，糖基化或磷酸化)。本发明的核酸分子编码人造的(即，合成的)变体蛋白或其多肽片段的变体，其与其所来源的亲代蛋白的氨基酸序列具有至少60%，例如，至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性，所述亲代蛋白可以是天然存在的(天然的或野生型的)序列或随后进一步修饰的变体序列。术语“融合多肽”或“融合蛋白”指包含在N-末端和/或C-末端与一个或多个异源序列(例如非OgLuc多 肽)连接的参考蛋白(例如，OgLuc变体)的嵌 合蛋白。异源序列可包括，但不限于，报告子蛋白诸如HALOTAChMi合蛋白(Promega Corp.)、FlAsH(荧光素含砷螺旋结合剂)和ReAsH(红色含砷螺旋结合剂)(例如，LUM10™标签识别序列(InvitiOgen))、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(β -Gal)、内酰胺酶(P-gal)、新霉素抗性(Neo)、⑶S、吡喃半乳糖、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(例如，海肾(Renilla reniformis)荧光素酶、萤火虫突光素酶(例如，北美萤火虫(Photinus pyralis)或Photuris pennsylvanica)或叩头虫突光素酶(例如，牙买加叩头虫(Pyrophorus plagiophthalamus)或PyrearinustermitiIIuminans)或萤火虫(glowworm)突光素酶(例如，Phrixothrix hirtus)、木糖苷酶、胸苷激酶、阿拉伯糖苷酶和SNAP标签、CLIP标签、ACP标签和MCP标签(NewEngland Biolabs)。在一个实施方案中，嵌合蛋白包含在N-末端与HALOTAG®融合蛋白(Promega Corp.)连接的OgLuc变体。在另一个实施方案中，嵌合蛋白包含在C-末端与I 1/\Ι..Λ)ΤΛ Κ.融合蛋白连接的OgLuc变体。 [0281] 已知核酸包含不同类型的“突变”，指相对于野生型序列在核苷酸的序列中特定的碱基位置处的改变。突变还可指一个或多个碱基的插入或缺失以使核酸序列不同于参考，例如，野生型序列，或用终止密码子来替代。“置换”指序列中特定位置处的氨基酸的改变，例如，在第4位从A变为 Ε。 [0282] 术语“载体”指其中可插入或克隆DNA的片段的核酸分子，其可用于将DNA区段转移到细胞中并能够在细胞中复制。载体可来源于质粒、噬菌体、病毒、粘粒和类似的载体。 [0283] 如本文所用的，术语“野生型”或“天然的”指具有从天然存在的来源分离的基因或基因产物的特性的基因或基因产物。野生型基因是在人群中最常被观察到的且从而被任意命名为基因的“野生型”形式。相反，术语“突变体”指当与野生型基因或基因产物相比较时在序列中和/或功能性质中表现出修饰(即，改变的特性)的基因或基因产物。注意的是天然存在的突变体可被分离；这些通过当与野生型基因或基因产物相比较时其具有改变的特性的事实所鉴定。 [0284] 示例性的多核苷酸和蛋白 [0285] 本发明包括相对于野生型OgLuc具有至少一个氨基酸置换的OgLuc变体或其蛋白片段，例如，具有缺失，例如I至约5个残基的缺失的那些，和其嵌合体(融合体)(参见美国专利公布第2009/0253131号和WIPO公布第W02007/120522号，其公开内容通过引用并入本文)，该置换导致OgLuc变体具有增强的稳定性、增强的发光，例如，增大的发光发射、更高的发光动力学稳定性和/或改变的发光颜色。OgLuc变体的序列与对应的野生型OgLuc的氨基酸序列基本上相同。具有基本上相同的序列的多肽或肽意味着氨基酸序列较大程度地，但非完全地，相同并保留着与其有关的序列的功能活性。通常，两个氨基酸序列若其为至少 60%,例如，至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%,但少于 100%的氨基酸序列同一'I"生则基本上相同。在一些实施方案中，OgLuc变体由重组的多核苷酸所编码。在一些实施方案中，OgLuc变体，或其功能片段，具有不超过5个差异，或更优选地不超过4个、3个、2个或I个差异，或最优选地无差异，其中差异发生在对应于根据表4的式(VII)的模式位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17或18上。差异还可以包括表4的模式位置之间的空位、插入或交换。 [0286] 本发明的OgLuc变体蛋白或融合蛋白可通过重组方法或通过固相化学肽合成方法来制备。这样的方法是本领域中已知的。 [0287] 使用的方法和试剂盒 [0288] 本发明的化合物和蛋白可以已使用荧光素酶和荧光素酶底物，例如，腔肠素的任何方法来使用。例如，其可用于生物发光方法中，该方法使用了腔肠素的类似物来检测样品中的一种或多种分子，例如，酶、酶促反应的辅因子、酶底物、酶抑制剂、酶活化剂或OH基，或一种或多种条件，例如，氧化还原条件。样品可包括动物(例如，脊椎动物)、植物、真菌、生理溶液(例如，血液、血浆、尿液、粘液分泌和类似的生理溶液)、细胞、细胞裂解物、细胞上清液或纯化的细胞级分(例如，亚细胞级分)。可对这样的分子的存在、量、光谱分布、发射动力学或比活性进行检测或定量 。可在溶液中检测或定量分子，所述溶液包括多相溶液(例如，乳化液或悬浮液)或固体载体(例如，颗粒、毛细管或检测容器)。在一些实施方案中，OgLuc变体可用于基于发光的测定以检测感兴趣的酶，例如，CYP450酶、MAO A酶或B酶，半胱天冬酶等。新型腔肠素可与发光蛋白诸如水母发光蛋白、螅蛋白或iPhotina—起使用。在一些实施方案中，OgLuc变体可用作另一分子(例如，荧光团、生色团或毫微粒)的能量供体。 [0289] 本发明还提供了编码转录报告子的多核苷酸。在一些实施方案中，OgLuc变体或其片段可与转录调控序列(例如，一个或多个增强子、启动子、转录终止序列或其组合)可操作地连接以形成表达盒。例如，OgLuc变体可与最小启动子和cAMP-应答元件(CRE)可操作地连接。 [0290] 本发明的蛋白可用作生物感受器，例如，OgLuc变体，其在另一分子(例如，一个或多个感兴趣的分子)的存在下，或在某些条件下，具有一种或多种改变的活性。在与感兴趣的分子相互作用后或在某些条件下，生物感受器经历构象改变或化学上的改变，导致发光的酶活性的改变，例如，比活性、光谱分布或发射动力学。例如，本发明的OgLuc变体，例如，循环交换的变体，可包括与感兴趣的分子相互作用的区域。可选地，例如，OgLuc变体可与能量受体相偶联，例如，荧光蛋白，并包括改变从酶到能量受体的能量转移的效率的相互作用区域。例如，可通过将适宜的感受器区域插入到OgLuc变体序列中而生成生物感受器以检测蛋白酶、激酶、配体、结合蛋白诸如抗体、环核苷酸诸如cAMP或cGMP，或金属诸如钙。可将一种或多种感受器区域插入到多肽序列的C-末端、N-末端和/或一个或多个适宜的位置，其中感受器区域包括一个或多个氨基酸。在循环交换的OgLuc变体的情况下，可将感受器区域插入到亲代OgLuc变体的N-末端和C-末端之间。此外，所插入的感受器区域的一个或全部可包括接头氨基酸以将感受器与OgLuc变体的其余部分相偶联。荧光素酶生物感受器的例子在美国专利申请公布第2005/0153310号和第2009/0305280号和PCT公布第W02007/120522号A2中公开，其每一项在此通过引用并入。 [0291] 在不同的实施方案中，本文所公开的OgLuc变体可用于将能量转移(例如，在生物发光共振能量转移(BRET)分析中)到能量受体。例如，在BRET分析中所用的OgLuc变体可用于确定两个分子是否能够在细胞中相互结合或共定位。例如，OgLuc变体可用作与感兴趣的分子或蛋白组合的生物发光供体分子以构建第一融合蛋白。在不同的实施方案中，第一融合蛋白包含OgLuc变体和感兴趣的蛋白。在不同的实施方案中，包含OgLuc变体的第一融合蛋白可用于BRET分析以检测包括但不限于细胞裂解物、完整的细胞和活体动物的系统中的蛋白/蛋白相互作用。在不同的实施方案中，HALOTAG®可用作荧光受体分子。在一些实施方案中，HALOTAG®,可与感兴趣的第二蛋白或OgLuc变体融合。例如OgLuc变体可与HALOT AGt®融合，在细胞或动物中表达，并利用荧光HALOTAG©配体诸如HALOTAG® TMR配体进行标记。随后可在细胞渗透OgLuc底物存在下激发融合体发荧光。在一些实施方案中，利用与荧光蛋白相组合的OgLuc变体可进行BRET，所述荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、或红色荧光蛋白(RFP)或荧光标记物包括荧光素、罗丹明绿、俄勒R绿或Alexa488，仅为几个非限制性例子。 [0292] 在不同的实施方案中，本发明的OgLuc变体和新型腔肠素可用于蛋白互补测定(PCA)以检测两个生物分子例如多肽的相互作用。例如，本发明的OgLuc变体可在允许分离的位点分成两个片段，且所分离的OgLuc变体的每个片段可与被认为相互作用的感兴趣的一对多肽(例如，FKBP和FRB)之一融合。若感兴趣的两种多肽事实上确实相互作用了，OgLuc片段则进入到相互接近以重新构成功能性的、活性的OgLuc变体。在一些实施方案中，利用天然的或已知的腔肠素或本发明的新型腔肠素可随后检测和测量重构OgLuc变体的活性。在一些实施方案中，分裂的OgLuc变体可用于与lac-Z (Langley 等，PNAS72:1254-1257 (1975))或核糖核酸酶 S (Levit and Berger, J.Biol.Chem.251:1333 - 1339(1976))相似的更通用的互补系统。在一些实施方案中，可将已知与另一 OgLuc变体片段(定名为“B”)互补的OgLuc变体片段(定名为“A”)与靶蛋白融合，且可经由包含片段B的细胞或细胞裂解物中的发光监测所得的融合体。在一些实施方案中，片段B的来源可以是相同的细胞(例如，如果将片段B的基因插入到细胞的基因组中或包含于细胞中的另一质粒上)或其可以是来源于另一细胞的裂解物或纯化的蛋白。在一些实施方案中，可利用片段B和能够附着于固体载体的多肽诸如HALOTA(W之间的融合来捕捉或固定该相同的融合蛋白(片段A)。在一些实施方案中，发光可用于证明成功的捕捉或定量所捕捉的物质的量。[0293] 在不同的实施方案中，本发明的OgLuc变体和/或新型腔肠素可用于定量腔肠素。在一些实施方案中，腔肠素(例如，天然的或已知的腔肠素，或本发明的新型腔肠素)可用作特定的生物化学活性例如凋亡和药物代谢的探针。在一些实施方案中，通过感兴趣的特定的酶能够对其起作用的“前腔肠素”或“前底物”可将腔肠素浓度与特定的酶活性相偶联。在一些实施方案中，前腔肠素是当与荧光素酶组合时不能直接支持发光但可通过感兴趣的特定的酶经过催化加工被转化为腔肠素的分子。在一些实施方案中，可将诸如药物代谢中所用的方法用于酶，例如，细胞色素P450酶、单胺氧化酶和谷胱甘肽S转移酶；和凋亡，例如半胱天冬酶。例如，腔肠素(例如，天然的或已知的腔肠素，或本发明的新型腔肠素)可被修饰以包含可裂解的基团，比如6’ -O-甲基。在一些实施方案中，当与特定的细胞色素P450酶一起孵育时，6’ O-甲基被裂解，且前腔肠素被转化为可利用本发明的OgLuc变体检测的腔肠素。在一些实施方案中，前腔肠素可与支持发光所需的其他组分(例如，发光蛋白诸如本发明的OgLuc变体)组合以提供单一的试剂和均相测定。例如，当将试剂添加到样品中时，随前腔肠素被转化为腔肠素而生成发光。在不同的实施方案中，对于可与从前腔肠素生成腔肠素相关联的其他酶、小分子或其他细胞过程可开发相似的测定。 [0294] 在一些实施方案中，本发明的OgLuc变体和/或新型腔肠素可用作遗传转录报告子系统。在一些实施方案中，OgLuc变体可与发射不同的波长的光的荧光素酶(例如，红叩头虫荧光素酶(CH ROMA-LUC™; Promega Corp.))多重复合。例如，若本发明的OgLuc变体用作功能报告子，则红色的CHR0MA-LUC™荧光素酶可用于控制对遗传调控的非特异性作用或对于转染效率进行标准化。在一些实施方案中，利用具有波长区分滤光片的光度计可容易地解析从OgLuc变体(约460nm)和红CHR0MA-LUC™(约610nm)产生的发光，使能够测量来自相同的样品的两种信号。在另一个例子中，本发明的OgLuc变体可用作转录报告子并与测定试剂中所含的发射不同波长的荧光素酶相配对。例如，本发明的OgLuc变体可用作转录报告子并与水母发光蛋白或cAMP循环交换的萤火虫荧光素酶生物感受器配对，或同时与二者配对，以检测单一样品中的多个途径。在这一系统中，例如，水母发光蛋白可用于检测和/或测量钙，生物感受器用于检测和/或测量cAMP，和OgLuc变体用于监测下游基因表达。在另一例子中，OgLuc变体可与一种或多种另外的荧光素酶一起使用，其中可通过使用选择性的酶抑制剂而分别地测量每种荧光素酶的发光。例如，第一荧光素酶的发光可在添加适当的底物和缓冲液后测量，然后在随后添加适当的底物和缓冲液和一种或多种对于第一荧光素酶具有选择性的抑制剂后测量第二荧光素酶。在另一个例子中，测定试剂中所含的荧光素酶可用于测量细胞生理学的特定的方面，例如，测量ATP以评估细胞生存力，或测量半胱天冬酶活性以评估细胞凋亡。 [0295] 在不同的实施方案中，本发明的OgLuc变体在难以转染细胞系或可能甚至在不分裂的原代细胞(例如，干细胞或H印G2细胞)中用作报告子。由于其高信号强度，当转染效率低时，本发明的OgLuc变体将能够使发光可检测。在一些实施方案中，OgLuc变体可在尤其对与转染相关的条件敏感的细胞(例如，其对增高的DNA浓度敏感或对转染试剂的添加敏感)中用作报告子。这样，在不同的实施方案中，由于本发明的OgLuc变体的增强的发光，利用较低的DNA浓度、较少的转染试剂和/或较短的开始测定前的转染后时间而使对敏感性细胞具有降低的毒性负担而可实现足够水平的发光。在不同的实施方案中，OgLuc变体的增强的发光允许在较晚的时间点检测信号。在又一些另外的实施方案中，OgLuc变体可用作单拷贝天然启动子的报告子。 [0296] 在不同的实施方案中，本发明的OgLuc变体可用作感兴趣的靶蛋白的融合标签，作为监测靶蛋白的胞内水平的途径。在一些实施方案中，OgLuc变体可用于监测参与细胞中应激应答途径(例如DNA损伤、氧化性应激、炎症)的特定的蛋白，作为探查不同类型的刺激物可能在这些途径中所起作用的途径。在一些实施方案中，OgLuc变体还可用作监测靶蛋白的细胞贩运的工具。例如，OgLuc变体还可与病毒基因组(例如HIV，HCV)融合从而可在用有效的抗病毒剂处理后监测细胞中的滴度水平，即感染力。在一些实施方案中，变体还可与绿色荧光蛋白(GFP)或ΗΛ[...()ΤΛ('Η<;;融合(除靶蛋白外)以用于荧光激活的细胞分选(FACS)以鉴定高表达克隆。 [0297] 在不同的实施方案中，OgLuc变体的增强的信号和OgLuc基因的小尺寸可有利于表达细胞质形式或分泌形式的本发明的OgLuc变体的稳固的、稳定的细胞系的鉴定。相对小的基因序列能够降低由外源DNA整合到细胞基因组中导致的基因不稳定性的可能性。 [0298] 在不同的实施方案中，本发明的OgLuc变体可被整合到多种不同的免疫测定概念中。例如，OgLuc变体可与第一或二抗融合以提供用于特定的分析物的检测方法。作为另一个例子，OgLuc变体可与蛋白A或蛋白G融合，且融合体然后可用于检测与特定分析物结合的特定的抗体。作为另一个例子，OgLuc变体可与链酶亲和素结合并用于检测与特定的分析物结合的特定的生物素化的抗体。作为又一个另外的例子，OgLuc变体的互补片段可与一抗和二抗融合，其中所述一抗识别特定的分析物，和所述二抗识别一抗。在一些实施方案中，OgLuc变体活性将在分析物存在下重新构成。作为又一个另外的例子，OgLuc变体可与分析物(例如，前列腺素)轭合并用于竞争性三明治ELISA形式。与分析物轭合的OgLuc变体还可用于检测能够结合分析物的抗体，其中结合活性允许OgLuc变体选择性地与抗体连接。利用海肾属荧光素酶用于定量地测量针对抗体原靶标的患者抗体滴度的例子是荧光素酶免疫共沉淀系统(Burbelo 等，Expert Review of Vaccines9 (6): 567-578 (2010))。 [0299] 在不同的实施方案中，本发明的OgLuc变体和新型底物可用于检测活细胞中的发光。在一些实施方案中，OgLu c变体可在细胞中表达(作为报告子或其他)，且用腔肠素(例如，新型腔肠素，诸如PB1-3939)处理细胞，其将渗透培养中的细胞，与OgLuc变体反应并生成发光。除作为细胞渗透物质外，PB1-3939关于细胞生存力显示了与天然腔肠素相当的生物相容性。在一些实施方案中，可合成已知提高介质中的天然腔肠素的稳定性的包含化学修饰的PB1-3939的形式并将其用于更稳固的、活细胞的基于OgLuc变体的报告子测定。在又一些另外的实施方案中，利用不同的显微术和成像技术可测定包含本发明的OgLuc变体和/或新型腔肠素的样品(包括细胞、组织、动物等)。在又一些另外的实施方案中，分泌型OgLuc变体作为活细胞报告子系统的部分在细胞中表达。 [0300] 在不同的实施方案中，本文所公开的OgLuc变体和/或新型腔肠素可作为试剂盒的部分来提供。试剂盒可包括如本文所公开的一种或不同的OgLuc变体(以多肽、多核苷酸或两者的形式)和/或腔肠素，以及适宜的试剂和能够使用户进行诸如本文所公开的那些测定的说明书。腔肠素可以是本文所公开的天然的、已知的或新型腔肠素中的任何一种。试剂盒还可包括一种或多种缓冲液，比如本文所公开的那些。 [0301] 编码修饰的荧光素酶和其融合体的载体和宿主细胞 [0302] 一旦制备了编码OgLuc变体或其片段(诸如具有发光活性的片段或可与另一分子互补以导致发光活性的片段，或其具有发光活性的融合体)的所需要的核酸分子，可制备编码OgLuc变体或其片段(例如，用于互补的片段或其具有发光活性的融合体)的表达盒。例如，将包括编码OgLuc变体的核酸序列的核酸分子与转录调控序列(例如，一种或多种增强子，启动子，转录终止序列或其组合)可操作地连接以形成表达盒。可将核酸分子或表达盒导入到载体中，例如，质粒或病毒载体，其任选地包括可选择的标志物基因，和被引入到感兴趣的细胞的载体，例如，原核细胞诸如大肠杆菌、链霉菌属某种(Streptomycesspp.)、芽孢杆菌属某种(Bacillus spp.)、葡萄球菌属某种(Staphylococcus spp.)和类似的原核细胞，以及真核细胞，包括植物(双子叶植物或单子叶植物)、真菌(包括酵母，例如，毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))或哺乳动物细胞,其裂解物或可在体外导入到转录/翻译混合物中。哺乳动物细胞包括但不限于牛科动物、山羊、羊科动物、犬科动物、猫科动物、非人灵长类动物细胞，例如猿猴细胞和人类细胞。哺乳动物细胞系包括，但不限于，CH0、C0S、HEK293、HeLa, CV_1、SH-SY5Y和NIH3T3细胞，虽然还可使用大量的其他细胞系。 [0303] 所编码的OgLuc变体的表达可受能够在原核细胞或真核细胞中表达的任何启动子包括合成的启动子所控制。原核启动子包括，但不限于，SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子,包括具有启动子活性的任何片段。真核启动子包括，但不限于，组成型启动子，例如，病毒启动子诸如CMV、SV40和RSV启动子，以及可调控的启动子，例如，可诱导型或可抑制型启动子诸如tet启动子、hsp70启动子和受CRE调控的合成的启动子,包括具有启动子活性的任何片段。所编码的OgLuc变体的表达还可受转录后程序的控制，诸如受RNA加工或翻译的调控所调控的程序，例如，通过RNA1、miRNA、shRNA、siRNA或通过RNA或蛋白降解。本发明的核酸分子、表达盒和/或载体可通过任何方法被引入到细胞中，包括但不限于，钙介导的转化、电穿孔、微注射、脂质转染和类似的方法。 [0304] 编码OgLuc变体的优化的序列和载体和宿主细胞 [0305] 还提供的是包括编码本发明的OgLuc变体、其功能片段或其融合蛋白的核酸序列的分离的核酸分子(多核苷酸)。在一些实施方案中，分离的核酸分子包括对于在至少一种所选择的宿主中表达进行优 化的核酸序列。优化的序列包括密码子优化的序列，即，在一种生物体中相对于另一种生物体(例如，远亲生物体)更频繁地使用的密码子，以及修饰以添加或修饰Kozak序列和/或内含子，和/或以去除不需要的序列，例如，潜在的转录因子结合位点。当被导入到宿主细胞中时，这样的优化的序列可提供增强的表达，例如，增高的水平的蛋白表达。优化的序列的例子公开于美国专利第7，728，118号和美国专利申请公布第2008/0070299号、第2008/0090291号和第2006/0068395号，其每一项通过引用并入本文。 [0306] 在一些实施方案中，多核苷酸包括编码本发明的OgLuc变体的核酸序列，该核酸序列对于在哺乳动物宿主细胞中的表达而进行优化。在一些实施方案中，优化的多核苷酸不再与对应的非优化的序列杂交，例如，在中度或高度严格条件下不与非优化的序列杂交。术语“严格”用于指进行核酸杂交的温度、离子强度和其他化合物的存在的条件。在“高度严格”条件下，核酸碱基配对将仅发生在具有高频率的互补碱基序列的核酸片段之间。这样，当需要核酸不互相完全互补地杂交或一起退火时，常使用“中度”或“低度”严格的条件。本领域熟知可使用大量的等效条件以构成中度或低度严格条件。[0307] 在一些实施方案中，多核苷酸与对应的非优化的序列具有至少90%，例如，少于80%的核酸序列同一性，且任选地编码与非优化的序列所编码的多肽具有至少60%，例如，至少 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性。还提供了包括分离的核酸分子(例如，具有优化的核酸序列)的构建体(例如表达盒和载体)，以及包括分离的核酸分子、构建体或载体的试剂盒。 [0308] 将包括编码本发明的OgLuc变体、其片段或其融合体的核酸序列的核酸分子对于在特定的宿主细胞中的表达任选地进行优化，且还任选地与转录调控序列例如一个或多个增强子、启动子、转录终止序列或其组合可操作地连接以形成表达盒。 [0309] 在一些实施方案中，编码本发明的OgLuc变体、其片段或其融合体的核酸序列通过替代密码子来进行优化，例如，用在特定的(所选择的)细胞中优先使用的密码子来替代亲代OgLuc序列中至少25%的密码子。优选的密码子在所选择的细胞中具有相对高的密码子使用频率，且优选地其导入导致了所选择的宿主细胞中所存在的转录因子的相对少的转录因子结合位点，和相对少的其他不需要的结构属性。不需要的结构属性的例子包括，但不限于，限制酶位点、真核序列元件、脊椎动物启动子组件和转录因子结合位点、应答元件，大肠杆菌序列元件、mRNA 二级结构。这样，优化的核酸产物可具有由增高的密码子使用频率所导致的增高的水平的表达，和由降低的数目的不需要的转录调控序列所引起的不适当的转录行为的降低的风险。 [0310] 分离的和优化的核酸分子在30%、35%、40%以上或45%以上，例如50%、55%、60%或更多的密码子上可具有与对应的野生型核酸序列不同的密码子组成。本发明中所用的示例的密码子是在特定的生物体中对于相同的氨基酸比至少一种另外的密码子更频繁地使用的那些密码子，且，在一些实施方案中，也不是该生物体中的低使用率密码子和也不是用于核酸分子的表达的克隆或筛选的生物体中的低使用率密码子。并且，用于某些氨基酸(即，具有三个或更多个密码子的那些氨基酸)的密码子可包括比其他(非优选的)密码子更频繁地使用的两个或多个密码子。在一种生物体中比在另一种生物体中更频繁地使用的密码子在核酸分子中的存在导致了当将使用那些更频繁使用的密码子的核酸分子导入到生物体的细胞中时，在那些细胞中以高于那些细胞中的野生型或亲代的核酸序列的表达的水平来表达。 [0311] 在本发明的一些实施方案中，不同的密码子是在哺乳动物中更频繁使用的那些密码子，而在又一些另外的实施方案中，不同的密码子是在植物中更频繁使用的那些密码子。对于不同的生物体优选的密码子是本领域中已知的，例如，参见http://www.kazusa.0r.jp./codon/。特定类型的哺乳动物，例如人，可具有一个与另一类型的哺乳动物不同的一套优选的密码子。相似地，特定类型的植物可具有一套与另一类型的植物不同的优选的密码子。在本发明的一个实施方案中，不同的密码子的大部分是在想要的宿主细胞中优选的密码子。对于包括哺乳动物(例如，人)和植物的生物体优选的密码子是本领域中已知的(例如，Wada 等，Nucl.Acids Res., 18:2367 (1990) ;Murray 等，Nucl.AcidsRes.， 17:477(1989))。 实施例 [0312] 参考实施例1——α氨基腈(化合物I)的合成:[0313] [0314] 将烧瓶装满亚硫酸氢钠(71.4mmol)和17mL水。将含醛(69.3mmol)的14mL四氢呋喃(THF)溶液以保持内部温度在60°C以下的速率滴加到上述烧瓶中。在室温下将所得的悬浮液搅拌40分钟，并在2分钟的时间添加氢氧化铵溶液(4.85mL)。将所得的溶液进行磁力搅拌，同时在油浴中在60°C下加热I小时，且然后在室温下放置过夜。将溶液在冰/盐水浴中冷却直至所测量的内部温度在5°C以下。将含氰化钠(71.4_ο1)的14mL水溶液在30分钟的时间添加到上述溶液中。将所得的混合物在约10°C下搅拌20分钟，在30°C下搅拌2小时，并在室温下搅拌18小时。将反应混合物萃取到三份200mL的乙醚中，并在无水硫酸钠中干燥合并的萃取物。将混合物过滤并将溶液在冰浴中冷却20分钟，将氯化氢气体添加到该搅拌的溶液中直至停止沉淀，并将悬浮液搅拌I小时。通过过滤分离固体并用三份50mL的乙醚漂洗。在真空中干燥物质，获得6.4g(47.5mmol)的白色固体(69%)。程序修改自:Freifelder 和 Hasbrouck, "Synthesis of Primaryl, 2-Diaminesby Hydrogenation of alpha-Aminonitriles，"Journal of the American ChemicalSociety,82 (3):696-698(1960)。 [0315] 参考实施例2——2-氧代-2-苯乙醛肟(化合物2)的合成 [0316] [0317] 将烧瓶装满叔丁醇钾(58mmol)和63mL叔丁醇。搅拌混合物直至形成溶液，滴加含适当的二苯甲酮(50mmol)的35mL叔丁醇溶液在15分钟的时间。将反应混合物搅拌I小时,并在5分钟的时间添加纯的亚硝酸异戊酯(75mmol)。监测反应混合物的完成并利用IOOmL的庚烷进行稀释。通过抽滤收集所得的固体(38mmol)并在真空下干燥直至恒重。程序修改自:Hagedorn 等，Chem.Ber., 98:193 (1965)。 [0318] 参考实施例3——吡嗪衍生物(化合物3)的合成 [0319] [0320] 将3- 口烧瓶装配温度计、隔膜和氩气管道。将氨基腈(47.5mmol)、干燥的吡啶(190mL)和肟(61.75mmol)添加到其中。彻底搅拌混合物15分钟，并在35分钟的时间分5份添加四氯(双-卩比唳)钛复合物(94.9mmol),保证内部温度保持在40°C以下。添加完成后，在室温下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物以小部分缓慢地添加到碳酸氢钠的溶液(174mL水含有21.75g)中。将所得的混合物彻底搅拌15分钟并添加80g硅藻土。将悬浮液搅拌30分钟并通过Buchner漏斗过滤。将滤液移到分液漏斗，并将滤饼悬浮于400mL的甲醇中。将混合物搅拌30分钟并再次过滤。重复该过程共四次。将甲醇滤液组合并浓缩，将残余物溶于200mL的乙酸乙酯(EtOAc)中。将溶液添加到含原始滤液的分液漏斗中，并用三份IOOmL的EtOAc进一步萃取混合物。用两份IOOmL的饱和碳酸钠和两份IOOmL的盐溶液洗涤合并的萃取物。蒸发有机溶剂，获得棕色油的粗氧化吡嗪。将物质溶于3mL的甲醇中，添加89mL的二氯甲烷(DCM)。向该溶液中添加锌粉(80.7mmol)，并将混合物在冰浴中冷却直至内部温度达15°C。用冰醋酸(3mL)处理混合物并在油浴中加热40分钟至30°C的内部温度。将反应混合物冷却至室温并通过硅藻土的垫料进行过滤。用DCM漂洗滤饼，并用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤合并的滤液。通过利用庚烷/EtOAc梯度在硅胶上通过色谱对粗产物进行纯化。这得到棕色固体的2.9g(29%)吡嗪。程序修改自=Kishi等，"The structure confirmation of the light-emitting moiety of bioluminescentjellyfish."Tetrahedron Lett., 13(27):2747(1972)。 [0321] 参考实施例4——腔肠素的合成 [0322] 方法A:(以下化合物可通过方法A来合成:化合物PB1-3840、PB1-3886、PB1-3857、PB1-3887、PB1-3913、PB1-3894、PB1-3896、PB1-3897、PB1-3841 和 PB1-3842) [0323] [0324] 将烧瓶装满卩比嗪(8.25mmol)、丙酮酸(14.0mmol)、樟脑磺酸(0.8mmol)和无水2-甲基THF(150mL)。该烧瓶上安装有冷凝器和具有4埃分子筛的索氏抽提器，并将反应混合物在110°C的油浴中加热18小时。将分子筛用新鲜的替换，并持续回流24小时。将反应混合物过滤并浓缩,将残余物溶于EtOAc (200mL)中。用三份25mL的饱和碳酸氢钠溶液、IOOmL的0.1M的醋酸钠缓冲液，pH5和IOOmL盐溶液洗涤溶液。在硫酸镁中干燥溶液，过滤和浓缩以得到2.3g(6.2mmol,75% )的粗烯胺/酸。将该物质溶于无水THF(30mL)中，并将溶液在冰/水浴中冷却10分钟。向其中添加碳化二亚胺(9.0mmol)和纯的二异丙基乙胺(14.9mmol)。10分钟后除去冷水浴，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。向该反应混合物中添加50mL的0.1M的醋酸钠缓冲液，pH5，并彻底搅拌混合物10分钟。用三份IOOmL的EtOAc萃取该两相混合物，并用盐溶液洗涤合并的萃取物。浓缩有机溶剂，并通过利用DCM/甲醇梯度在娃胶上通过色谱来纯化残余物。这得到336mg(0.94mmol, 16%)红色固体的脱水腔肠素。将该物质悬浮于IOmL甲醇中并在冰浴中冷却该混合物。在I小时的时间向其中以三份添加硼氢化钠(lOOmg，2.6mmol)。再搅拌反应混合物30分钟，并滴加纯的冰醋酸直至达到PH5。浓缩溶液并用15mL的水研磨残余物。通过抽滤分离固体并在真空下干燥若干小时以得到318mg(94%)黄色固体的粗腔肠素。程序修改自:Kakoi和Inoue, Chem.Lett.11(3):299-300(1980)。 [0325] 方法B:(以下化合物可通过方法B来合成:化合物PB1-3882、PB1-3932、PB1-3881) [0326] [0327] 将烧瓶装满乙二醛(2.2mmol)、氨基吡嗪(1.1mmol)、乙醇(20mL)、12N盐酸(0.6mL)和水(ImL)。将反应混合物在回流下加热24小时并浓缩。将残余物通过利用DCM/甲醇梯度，在硅胶上通过柱色谱法进行纯化。这得到100mg(0.25mmol，23%)的黑色固体的腔肠素产物。程序修改自:Inoue 等〃Squid bioluminescence.11.1solation fromWatasenia scintillans and synthesis of 2-(p-hydroxybenzyl)-6-(p-hydroxyphenyl)-3, 7-dihydroimidazo[I, 2-a]pyrazin-3_one〃Chem.Lett., 4(2):141-4(1975)。 [0328] 方法C:新型腔肠素的合成(以下化合物可通过方法C来合成:PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889、PB1-4002) [0329] 根据先前所描述的方法可制备化合物4-(5-氨基-6-苄基吡嗪-2-基)苯酌.(Kishi 等.，Tetrahedron Lett.,13:2747(1972) ；Mosrin 等，OrganicLetters, 11:3406(2009) ；Kakoi, Chem.Pharm.Bull., 50:301 (2002))。 [0330] 2-氨基-3-苄基-5-苯基吡嗪的合成。将圆底烧瓶装满5g(33.5mmol)的2_异亚硝基苯乙酮、6.7g(36.8mmol)的2-氨基-3-盐酸苯基丙腈和IOOmL的无水卩比唳。将混合物冷却至-20°C并滴加4.6mL(40.0mmol)的TiCl4。将反应物在_20°C下保持30分钟，并加热至80°C持续2.5小时。蒸发溶剂，并将残余物溶于IL DCM。用饱和的NaHCO3和盐水洗涤该溶液。蒸发所有的挥发物，并将残余物再溶于乙醇(400mL)中。添加兰尼镍(2.0g，含水悬浮液)，并在I个大气压的氢气下搅拌反应物5天。将混合物通过硅藻土，并去除挥发物。在硅胶上对残余物进行色谱(庚烷/DCM)以得到2.5g(29%)的2-氨基-3-苄基-5-苯基吡嗪。 [0331] 2-氨基-3-苯基丙腈盐酸盐的合成。将圆底烧瓶装满65g(0.624mol)的亚硫酸氢钠和150mL的水。滴加含75g(0.624mol)的苯乙醛的150mL的THF。搅拌20分钟后，一次性添加37mL的14M氢氧化铵，并将混合物加热至60°C持续60分钟。冷却至0°C后，用150mL的水稀释混合物，并滴加含氰化钠(27.5g，0.560mol)的1OOmL水，保持内部温度在 10°C以下。添加后，将混合物加热至30°C，持续2小时并利用乙醚萃取。在用硫酸钠干燥后，蒸发所有挥发物，并将残余物溶于3.5L的乙醚中并用400mL的3.3M的乙醇HCl处理。过滤所得的沉淀物并在真空中干燥以得到55g(60%)的产物。 [0332] 3_(呋喃-2-基)-2_氧代丙酸的合成。向IOOmL的烧瓶中添加3_(呋喃-2-基)-2-氧代丙酸盐(940mg)以及23mL冷的6N NaOH。在90°C浴中搅拌不溶的混合物5分钟直至溶解。添加冷的IN HCl直至溶液为酸性的(约120mL)。用2X50mL EtOAc萃取溶液。用40mL盐溶液洗涤合并的有机层，并用Na2SO4干燥。蒸发溶液以得到540mg棕色固体。通过反相高效液相色谱(HPLC)梯度从97%的三氟乙酸(TFA)到乙腈(ACN)进一步纯化固体。 [0333] 3_(呋喃-2-基)-2_氧代丙酸乙酯的合成。向含异构体(E/Z)-2-甲酰胺基-3-(呋喃-2-基)丙烯酸乙酯(5.0g)的500mL烧瓶中添加220mL含1.4M(5%)HC1的50/50乙醇/水的冷冻的溶液。5小时后，反应在200mLEt0Ac和30mL盐水之间分开。用2X50mL EtOAc萃取水层。用lX50mL水和lX50mL盐水洗涤合并的有机层，并在Na2SO4中干燥。将有机层与26g硅藻土共蒸发并在80g 二氧化硅金上梯度从庚烷到EtOAc进行洗脱。蒸发适当的合并的组分而得到2.lg。 [0334] (E/Z)-2-甲酰乙基-3-(呋喃_2_基)丙烯酸乙酯的合成.向500mL烧瓶中添加50mL乙醚、Cu20(320mg)和呋喃醛(5.2mL)。将烧瓶在冰浴中冷却并添加2-异氰基醋酸乙酯(5.3mL)。1.5小时后，向反应中添加(5g)叔丁醇钾。4小时后，过滤非均质反应物。添加60mL30%的柠檬酸和20mL EtOAc并搅拌10分钟。用50mLEt0Ac萃取水层。在无水硫酸钠上干燥合并的有机层。将EtOAc层与24g硅藻土共蒸发并在80g 二氧化硅金上梯度从庚烷到EtOAc洗脱。使用了黄色的浆状物而不进行另外的纯化。 [0335] 2-氧代-3-(噻吩-2-基)丙酸.向250mL的烧瓶中添加(E/Z) _5_ (噻吩_2_基亚甲基)咪唑烷_2，4- 二酮(5.0g)和IOOmL的冷的6N NaOH。将混合物加热至100°C持续I小时。向冷却的溶液中添加浓缩的HCl直至酸性(pH=l)。用8X50mL 二乙醚萃取混合物。用50mL盐水洗涤合并的乙醚层，在Na2SO4上干燥并蒸发以得到3.36g固体。通过利用α, α, α -三氟甲苯重结晶进一步纯化样品而得到1.63g。 [0336] (E/Z)-5-(噻吩-2-基亚甲基)咪唑烷-2，4-二酮的合成。向250mL烧瓶中添加乙内酰脲(9.8g)和噻吩-2-甲醛(IOg)。向该混合物中滴加哌啶(9.6mL)。将混合物加热至100°C，持续I小时且然后倒入到300mL的IN HCl中。过滤固体，用水洗涤并在真空中干燥而得到4.9g固体。 [0337] [0338] 步骤1-向微波小瓶(IOmL)中添加适当的苯基卩比嗪_2_胺(lOOmg)、适当的丙 酮酸(2当量)、DCM(ImL)和1，I, 1-三氟乙醇(ImL)，在80°C下加热搅拌30分钟。将反应物在2克硅藻土上共吸附，并在真空中去除溶剂。将硅藻土装载到24g的球形硅胶上并用庚烷到乙酸乙酯的梯度洗脱。将适当的级分合并并蒸发。 [0339] 步骤2——将溶于THF (0.5mL)的步骤I中分离的物质在冰浴中冷冻。添加乙酸酐(25 μ L)、二甲基氨基吡啶(8.5mg)和三乙胺(25 μ L)。2小时后，在真空中去除THF的大部分。用30%的柠檬酸的水溶液(2mL)沉淀产物。用水(2mL)洗涤固体且然后溶于3mL DCM中。用I X 2mL水和I X 2mL盐水先后洗涤DCM。在2克硅藻土上共吸附DCM层，并在真空中去除溶剂。将硅藻土装载到12g球形硅胶上并用庚烷到DCM的梯度洗脱。合并适当的组分并蒸发。 [0340] 步骤3——在冰浴中冷冻溶于DCM(ImL)的来自步骤2的物质。向该溶液中添加甲醇(0.5mL)和含硼氢化钠的二甘醇二甲醚溶液(325yL，0.5M)。2小时后，添加乙酸(10 μ L)，且该溶液迅速地在30%柠檬酸(ImL)的水溶液和DCM(2mL)之间分开。在I克硅藻土上共吸附DCM层，并在真空中去除溶剂。将硅藻土装载到4g球形硅胶上并用DCM到EtOAc的梯度洗脱。合并适当的级分并蒸发。 [0341] 步骤4 (仅当R’ ’=0Ac)——将步骤3中的物质溶于THF (200 μ L)中并在冰浴中冷冻。将I当量1.35Μ甲醇钾的THF溶液添加到溶液中。30分钟后，反应物在DCM(ImL)和30%柠檬酸(ImL)之间分开。在0.5g硅藻土上共吸附DCM层，并在真空中去除溶剂。将硅藻土装载到4g的球形硅胶上并用DMC到EtOAc的梯度洗脱。合并适当的级分并蒸发。 [0342] 方法D:(以下的化合物可通过方法D来合成:化合物PB 1-3899、PB 1-3900、PB1-3925、PB1-3933、PB1-3946)——一般，在钯催化剂存在下在氢气的气氛下用2当量的 2-酮酸缩合氨基吡嗪。纯化并随后关于分子内缩合活化产生的α -氨基酸产生对应的咪唑并吡嗪酮。 [0343] [0344] 实施例5——8-苄基-6-(4-羟苯基)-2-丙基咪唑并[1，2_α]吡嗪_3(7Η)_酮的合成[0345] 2- ((3-苄基-5- (4-羟苯基)吡嗪_2_基)氨基)戊酸。将4_ (5_氨基_6_苄基批嗪-2-基)苯酌.(lOOmg,0.36mmol)与含 2-氧代戍酸(84mg, 0.72mmol)的乙醇(20mL)混合。添加Pd/C (含10%钯的活性炭，40mg)，并将反应混合物加热到65°C。通过N2气使空气排出，并将氢气球应用于反应烧瓶。持续搅拌反应物4小时。冷却下来之后，进行过滤，并通过快速色谱纯化所得的溶液(洗脱溶剂:含509ffit0Ac的庚烷)而得到黄色粉末的产物(70mg, 52%)。1H NMR(300MHz, CD2Cl2, δ ):8.31 (s, 1H)，7.82 (d, 2H, J=9.0Hz), 7.31 (m, 5H)，6 • 92 (d, 2H, J=9.0Hz)，5.34 (s, 2H)，4.20 (m, 1H), 1.10 (m, 2H)，0.98 (m, 2H)，0.87 (t, 3H) ; MS (ESI)m/z378.3(M+1)。 [0346] 8-苄基-6-(4-羟苯基)-2-丙基咪唑并[l，2_a]吡嗪-3 (7H)-酮。将2_((3_苄基-5-(4-羟苯基)吡嗪-2-基)氨基)戊酸(49mg，0.13mmol)溶于DCM(IOmL)中。先后添加卩比唳(0.5mL)和N, N’- 二环己基碳二亚胺(54mg, 0.26mmol)。在室温下缓慢搅拌反应混合物I小时。蒸发溶剂，并通过快速色谱纯化残余物(洗脱溶剂=EtOAc到DCM到含10%甲醇的 DCM)而得到黄色粉末的产物(40mg，86%)。1H NMR(300MHz，CD3OD, δ ): 7.35 (m, 8H), 6.88 (d, J=9.0Hz, 2H)，4.40 (s, 2H), 2.81 (t, J=7.5Hz, 2H), 1.81 (m, 2H)，1.02 (t, J=7.5Hz, 3H);MS (ESI)m/z359.0。 [0347] 实施例6——8-苄基-2-丁基-6-(4-羟苯基)咪唑并[1，2_a]吡嗪_3(7H)_酮的合成 [0348] 2-((3-苄基-5-(4-羟苯基)吡嗪_2_基)氨基)己酸。将4_(5_氨基_6_苄基批嗪-2-基)苯酹(200mg, 0.72mmol)与含2-酮基己酸钠盐(220mg, 1.44mmol)的乙醇(20mL)混合。添加Pd/C(含10%钯的活性碳，lOOmg)与若干滴乙酸，并将反应混合物加热到65°C。通过N2气体排出空气并将氢气球应用于反应烧瓶。持续搅拌反应物4小时。冷却下来后，过滤并通过快速色谱纯化所得的溶液(洗脱溶剂:含509ffit0Ac的庚烷)而得到黄色粉末的产物(130mg,46%) ο MS(ESI):m/z392.2 (M+1)。 [0349] 8-苄基-2-丁基-6-(4-羟苯基)咪唑并[1，2_a]吡嗪_3(7H)_酮。将2_((3_苄基-5-(4-轻苯基)卩比嗪-2-基)氨基)己酸(130mg, 0.33mmol)溶于DCM(IOmL)中。先后添加吡啶(0.5mL)和N，N’-二环己基碳二亚胺(137mg，0.67mmol)。在室温下缓慢地搅拌反应混合物I小时。蒸发溶剂,并通过快速色谱纯化残余物(洗脱溶剂:Et0Ac到DCM到含10% 甲醇的 DCM)而得到黄色粉末的产物(IIOmg, 89%)。1H NMR(300MHz, CD3OD, δ ):7.30 (m,8H), 6.88 (d, 2H), 4.40 (s, 2H), 2.84 (t, 2H)，1.77 (m, 2H)，1.51 (m, 2H)，0.89 (m, 3H) ; MS (ESI)m/z374.3(M+1)。 [0350] 实施例7——8-苄基-2-乙基-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3 (7H)-酮(PB1-3925)的合成 [0351] 2-((3-节基_5-苯基卩比嚷_2_基)氣基)丁酸。将3-节基_5-苯基卩比嚷_2_胺(200mg, 0.77mmol)与含 2-氧代丁酸(157mg, 1.54mmol)的乙醇(20mL)混合。添加 Pd/C (含10%钯的活性炭，IOOmg)，并将反应混合物加热到65°C。通过N2气体排出空气，并将氢气球应用于反应烧瓶。持续搅拌反应物4小时。冷`却下来之后，过滤，并通过快速色谱纯化所得的溶液(洗脱溶剂:含50%Et0Ac的庚烷)而得到黄色粉末的产物(90mg，34%)。1H NMR (300MHz, CD2Cl2, δ ):7.72 (s, 1Η)，7.32-7.48 (m, 10H)，4.46 (s, 2H)，4.20 (m, 2H)，2.25 (q, 2H)，O • 99 (t, 3H) ; MS (ESI): m/z348.3 (M+1)。[0352] 将2-((3-苄基-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)丁酸溶于DCM(IOmL)中。先后添加吡啶(0.5mL)和N，N’-二环己基碳二亚胺(137mg，0.67mmol)。在室温下缓慢地搅拌反应混合物I小时。蒸发溶剂，并通过快速色谱纯化残余物(洗脱溶剂=EtOAc到DCM到含10%甲醇的 DCM)而得到黄色粉末的产物(IIOmg, 89%) „ 1H NMR(300MHz, CD3OD, δ ): 7.26 (m, 3H)，6.84-7.07 (m, 8H)，4.03 (s, 2H)，2.47 (q, J=9.0Hz, 2H)，0.96 (t, J=9.0Hz, 3H) ;MS (ESI):m/z330.2(M+1)。 [0353] 实施例8——8-苄基-6-苯基-2-(3，3，3_三氟丙基)咪唑并[1，2_a]吡嗪-3 (7H)-酮的合成 [0354] [0355] 5，5，5-三氟-2-氧代戊酸。将4，4，4_三氟丁酸乙酯(lg，5.88mmol)和草酸二乙酯(3.87g，26.5mmol)溶于乙醇中。将乙醇钠(21%含于乙醇中，2.09g)添加到溶液中，并搅拌反应混合物0.5小时。蒸馏溶剂，并用EtOAc/水萃取残余物。收集有机层并在硫酸钠中干燥。过滤后，去除溶剂而得到澄清的液体。MS(ESI):m/z269.1 (M-1)。然后将液体溶于3N HCl (20mL)中，并回流反应混合物4小时。冷却下来之后，用EtOAc萃取反应混合物。收集有机层并在硫酸钠中干燥。过滤之后，去除溶剂，并将残余物直接用于下一步骤中。MS (ESI):m/zl69.7(M-1)。 [0356] 5, 5, 5- 二氟-2- ((3-节基_5-苯基卩比嚷_2_基)氟基)丁酸。将3-节基_5-苯基批嗪-2-胺(240mg, 0.92mmol)与含 5，5，5-三氟-2-氧代戍酸(150mg, 0.88mmol)的乙醇(20mL)混合。添加Pd/C (含10%钯的活性炭，IOOmg)，并将反应混合物加热到65°C。通过N2气体排出空气，并将氢气球应用于反应烧瓶。持续搅拌反应物4小时。冷却下来之后，过滤，并通过快速色谱纯化所得的溶液(洗脱溶剂:含509ffit0Ac的庚烷)而得到黄色粉末的产物(200mg, 54%)。1H NMR (300MHz, CD2Cl2, δ ): 11.45 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 7.94 (s, 1H) ，7.34 (m, 10H), 5.34 (s, 2H), 3.96-4.23 (m, 2H), 3.02-3.28 (m, 2H) ; FNMR:-76.3; MS (ESI):m/z416.1 (M+1)。 [0357]腔肠素(R1=H, R2=-CH2CH2CF3)。将 5，5，5_ 三氟 _2_ ((3_ 苄基 _5_ 苯基吡嗪 _2_ 基)氨基)丁酸(100mg，0.24mmol)溶于DCM(IOmL)中。先后添加吡啶(0.5mL)和N，N’- 二环己基碳二亚胺(100mg,0.48mmol)。在室温下缓慢地搅拌反应混合物I小时。蒸发溶剂，通过快速色谱纯化残余物(洗脱溶剂=EtOAc到DCM到含10%甲醇的DCM)而得到黄色粉末的产物(80mg, 87%)。1H NMR (300MHz, CD2Cl2, δ ):7.36 (m, 11H), 3.43 (s, 2H)，1.60-1.92 (m, 4H);FNMR:67.4(t, J=18Hz) ; MS (ESI):m/z398.2 (M+1)。 [0358] 实施例9——8-苄基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪-3 (7H)-酮(PB1-3939)的合成 [0359] [0360] 8-苄基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3 (7H)-酮:利用 3-(呋喃-2-基)-2-氧代丙酸和3-苄基-5-苯基吡嗪-2-胺作为起始材料由方法C进行合成。1H NMR (300MHz, dmso) δ 8.88 (s, 1H), 8.02 (d, J=7.9，2H), 7.61 - 7.38 (m, 6H), 7.37 - 7.14 (m, 3H)，6.38 (s, 1H)，6.26 (d, J=3.2，1H)，4.64 (s, 3H)，4.40 (s, 3H);对于 C24H20N3O2+ 计算的准确质量m/z+382.16,实测m/z+382。 [0361] 实施例10——8-苄基-6-苯基-2-(噻吩_2_基甲基)咪唑并[1，2_a]批嗪-3 (7H)-酮(PB1-3889)的合成 [0362] [0363] 8-苄基-6-苯基-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1，2_a]吡嗪_3(7Η)_酮:利用2-氧代-3-(噻吩-2-基)丙酸和3-苄基-5-苯基吡嗪-2-胺作为起始材料由方法C进行合成。1H NMR (300MHz, dmso) δ 8.85 (s, 1H)，7.99 (d, J=6.8，2H) ,7.63 - 7.02 (m, I OH), 6.94(dd, J=3.5, 5.1, 1H)，4.62 (s, 2H)，4.58 (s, 2H)，2.69 (杂质);对于 C24H2具OS+计算的准确质量m/z+398.13，实测 m/z+398。 [0364] 实施例11——8-环丙基-2-(4-羟基苄基)-6_苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪-3 (7H)-酮(PB1-3897)的合成 [0365] [0366] 8-环丙基-2-(4-羟基苄基)-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3(7H)_酮:利用3_环丙基-5-苯基吡嗪-2-胺和3- (4-羟苯基)-2-氧代丙酸作为起始材料利用方法A进行合成。对于C22H18N3CV计算的准确质量m/z-356.14，实测m/z_356。 [0367] 实施例12——8-苄基-2-甲基-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3 (7H)-酮(PB1-3932)的合成 [0368] [0369] 8-苄基-2-甲基-6-苯基咪唑并[l，2_a]吡嗪_3(7Η)_酮:利用1，1-二甲氧基丙烷-2-酮和3-苄基-5-苯基吡嗪-2-胺作为起始材料利用方法B进行合成。对于C2tlH18N3O+计算的准确质量m/z+316.14,实测m/z+316。 [0370] 实施例13——2-(4-羟基苄基)-8_甲基_6_苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3(7H)_酮(PB1-3896)的合成 [0371] [0372] 2-(4-羟基苄基)-8_甲基-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3 (7H)-酮:利用3_甲基-5-苯基吡嗪-2-胺和3- (4-羟苯基)-2-氧代丙酸作为起始材料利用方法A进行合成。1H NMR (300MHz, dmso) δ 8.84 (s, 1H)，8.00 (d, J=7.6，2H)，7.47 (dd, J=8.6，16.2，3H), 7.17 (d，J=7.3，2H)，6.69 (d, J=8.4，2H)，6.26 (s, 4H)，4.17 (s, 2H)，2.86 (s, 3H)，2.48 (s, 1H)。 [0373] 实施例14——8-苄基-2-(4-羟基苄基)-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3(7H)_酮(PB1-3840)的合成 [0374] [0375] 8-苄基-2-(4-羟基苄基)-6-苯基咪唑并[1，2_a]吡嗪_3(7H)_酮:利用3_(4_羟苯基)-2-氧代丙酸和3-节基-5-苯基批嗪-2-胺作为起始材料利用方法A进行合成。对于C26H22N3O2+计算的准确质量m/z+408.17,实测m/z+408。 [0376] 实施例15——受保护的腔肠素(稳定化的)(PB1-4377)的合成 [0377] 在室温下在氩气气氛中向PB1-3939、含碳酸钾(1.1当量)和碘化钾(1.1当量)的二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中添加I当量的特戊酸氯甲酯。通过薄层色谱监测反应进程，且完成后，在冰浴中冷却反应混合物几分钟，然后添加与反应体积相同的体积的水。利用适宜的有机溶剂(例如，EtOAc)萃取所得的混合物，并浓缩萃取物而得到粗产物。通过在硅胶上进行色谱而进一步纯化物质。 [0378] 实施例16——8-苄基-2- ((1-甲基-1H-咪唑_2_基)甲基)_6_苯基咪唑并[l，2-a]吡嗪-3(7H)_ 酮(PB1-4525)，8-苄基-6-(4-羟苯基)-2-((1-甲基-1H-咪唑-2-基)甲基)-6-苯基咪唑并[I, 2-a]吡嗪-3(7H)_酮(PB1-4540)和2-((IH-咪唑-2-基)甲基)-8-苄基-6-苯基咪唑并[I, 2-a]吡嗪_3(7H)_酮(PB1-4541)的合成 [0379] [0380] 在氩气气氛下向含IOmmol的2_甲基咪唑衍生物I或2的烧瓶添加20mL的无水THF,并在干冰/丙酮浴中冷却溶液至约-78V。在几分钟的时间向该冷却混合物中滴加9.3mmol正丁基锂(2.46M于己烷中)的溶液。在约_78°C下搅拌所得的溶液30分钟，并通过注射器添加6.7mmol的化合物3。将反应混合物搅拌3小时并利用添加20mL饱和的氯化铵溶液和20mL饱和的碳酸氢钠溶液来淬灭。除去冷浴，并在加温至室温之后，用3X IOOmL的EtOAc来萃取混合物。干燥(MgSO4)合并的萃取物，在真空中浓缩，并利用硅胶(EtOAc/庚烷)通过柱色谱纯化粗化合物4或5。 [0381] 将微波小瓶装满100mg(l当量)的化合物6和7和2当量的化合物8或9。向该混合物中添加4.5mL的乙醇和0.25mL的浓缩的HC1。在微波中在100°C下加热反应混合物1.5小时。将所得反应混合物添加到50mL的EtOAc中并随后用20mL的饱和的碳酸氢酶溶液和20mL的盐水洗涤。在真空中浓缩有机层，并利用硅胶(甲醇/ 二氯甲烷)通过柱色谱纯化残余物而得到化合物10-12。[0382] 实施例17-新型腔肠素的稳定性和自发光表征 [0383]确定了新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3889、PB1-3945、PB1-4002 或 PB1-3896 的稳定性和自发光表征。较高的稳定性和较低的自发光是底物/试剂中的吸引人的技术特征。 [0384]为确定稳定性，将 20 μ M 的新型腔肠素 PB1-3939、ΡΒΙ-3889、ΡΒΙ-3945、ΡΒΙ-4002或ΡΒΙ-3896，30μΜ的天然腔肠素或22μΜ的已知的腔肠素_h或已知的腔肠素_hh置于含 50mM CDTA、150mMKCl、50mM DTT、35mM 硫脲、1% TERGITOL® NP-9 (v/v)和 0.1% MAZU® DF204的报告试剂缓冲液中。在室温(即，22-24°C )下孵育复制的样品不同的时间长度且然后转移到-70°C。收集并冷冻所有的样品之后，将其融化并与不含酚红+0.1% PRIONEX⑩的40 μ L的DMEM中的含OgLuc变体IV的10 μ L细菌细胞裂解物相混合。在添加IV后5分钟读数样品的发光。 [0385] “Τ90”代表在室温即22°C下，发光信号衰减10%( S卩，活性减少10%)的所用的时间的量。从In RLU相对时间作图的数据的线性拟合的斜率确定了发光信号衰减的速率(“T9(l”)，其由以下等式所计算A=In(AzX) + (_k)，其中A=时间t时的强度，Atl=时间O时的强度，和k=衰减的速率。如表I中所示，已知腔肠素_h和-hh、新型腔肠素PB1-3939、PB1-3889、PB1-3945、PB1-4002和PB1-3896的T9tl值高于天然腔肠素，表明这些腔肠素是比天然腔肠素更稳定的化合物。 [0386] 为确定自发光特征，将HEK293细胞以15，000个细胞每孔在DMEM+10%FBS+丙酮酸盐中培养过夜。去除培养基并用在添加10%FBS的不依赖CO2的培养基中稀释的图2中所示的 20 μ M 的每种新型腔肠素，即 PB1-3939、ΡΒΙ-3889、ΡΒΙ-3945、ΡΒΙ-4002、ΡΒΙ-3841、PB1-3897、PB1-3896、ΡΒΙ-3925、ΡΒΙ-3894、ΡΒΙ-3932 和 ΡΒΙ-3840、天然腔肠素和已知的腔肠素、腔肠素-h和腔肠素_hh来替代。在添加底物后立刻在GLOMAX龙Luminometer (I秒/孔)上测量发光。背景发光为154±15RLU。表I显示了对于天然腔肠素标准化的自发光特征(“自发光(关于腔肠素标准化)”)。腔肠素_h比天然腔肠素具有更多的自发光，但所检验的所有其他的腔肠素具有较少的自发光。 [0387] 表1:利用不同的腔肠素进行的IV的稳定性实验和自发光表征 [0388] [0390] 实施例18—新颖腔肠素的毒性 [0391] 在ΗΕΚ293细胞中研究了新颖腔肠素的毒性。将ΗΕΚ293细胞以15，000/孔在DMEM+10%FBS+丙酮酸盐中生长过夜。去除培养基并用在含10%FBS的不依赖CO2的培养基中稀释的新型腔肠素化合物(或DMSO对照)替换。在添加化合物24小时后，根据制造商的说明利用CELLTITER- GLO®测定试剂(Promega Corp.)测量细胞生存力。并在(ίί.ΟΜΛΧ κ； LuminometeHl秒/孔)上测量发光。表2显示了新型腔肠素、已知的腔肠素和腔肠素 _hh 和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3889、PB1-3841、PB1-3897、PB1-3945、PB1-4002和PB1-3840在HEK293细胞中的毒性。除PB1-3840外，新型腔肠素具有至少与腔肠素_hh相同的毒性。新型腔肠素中的一些具有与天然腔肠素和腔肠素_h相同的毒性。 [0392] 表2:根据CELLTITER- GU)敗不同的腔肠素在HEK293细胞中的毒性 [0393] [0394] [0395]实施例I9-PBI-3939 的 Km [0396] 为确定PBI-3939的Km,根据制造商的说明利用HALOTAG® ProteinPurification System通过HALOTAG®融合体纯化OgLuc变体L27V (实施例26中所描述的)并在不含酚红和0.1% RI()NEX®的DMEM中稀释。将50 μ L测定缓冲液(100mMMES pH6，35mM硫脲，0.5% TER(HTOLf) NP-9 (v/v)，1mM CDTA，2mM DTT 和 150mM KCl)与不同的量的PB1-3939添加到50μ L稀释的酶中(约20ρΜ最终酶浓度)，并在22°C下在3分钟时测量发光。如图3中的数据表明，PBI-3939的Km约为10 μ M。 [0397]实施例 20-化合物 PBI-4525、ΡΒΙ-4540 和 ΡΒΙ-4541 的表征 [0398] 筛选化合物PB1-4525、ΡΒΙ-4540和ΡΒΙ-4541的能力以检测发光。为了分析，将20 μ M的每种化合物添加到测定缓冲液(IOOmM MESpH6，35mM硫脲，0.5% THRCiITOL®，NP-9 (v/v), ImM CDTA，2mMDTT 和 150mM KC1)，用 IOOmM HEPES pH7 将其调节到 pH7 以构建测定试剂。然后在不含酚红和0.1% PRIONFXX的DMEM中将测定试剂与36pM纯化的L27V02酶(实施例25B中所描述的)混合。作为对照，使用含20 μ M PB1-3939或PB1-4528的测定缓冲液。在将测定试剂添加到酶混合物中后3分钟如先前所描述的测量发光。表3表明了化合物PB1-4525、PB1-4540和PB1-4541可用于检测来自利用腔肠素的荧光素酶的发光。 [0399]表 3 [0400] [0402] 实施例21——OgLuc模式序列 [0403] 通过具有共同的三维结构和限定的催化活性可识别包括不同的荧光素酶种类的酶家族。因为酶家族与其他酶家族共有进化史，它们还将表现出其三维结构的相似性。通过不同方式的结构和功能分析，本发明人已鉴定了 OgLuc作为十足类荧光素酶的代表，具有与脂肪酸结合蛋白(FABP)显著相似的三维结构，表明了进化史的共性。这样，可将十足类荧光素酶定义为具有与FABP相似的特征性三维结构，并利用腔肠素作为底物以催化发光的发射。其他荧光素酶，例如，萤火虫荧光素酶，海肾属荧光素酶，细菌荧光素酶和类似的荧光素酶，具有明显不同的三维结构，表明其属于不同的酶家族并不共有进化史。甲藻(Dinoflagellate)荧光素酶具有表现出与FABP的一些相似性的三维结构，表明共有的进化史，但不利用腔肠素作为底物，且从而不属于与十足类荧光素酶相同的酶家族。 [0404] 因为氨基酸序列不如三维结构一样保守，仅基于序列比较来定义酶家族可能是困难的。例如，即使FABP具有特征性的桶形三维形状，其氨基酸序列的比较常显示非常低水平的序列同一性。尽管如此，序列同一性可用于表明三维结构的共性。若可将两个蛋白的氨基酸序列进行比对而显示>30%序列同一性，优选地>40%序列同一性，且最优选地>50%序列同一性，则两个蛋白将具有相似的三维结构(Chothia和Lesk，EMBO J.5 (4):823-826(1986) ; Tramontano, Genomics, 4:402 - 405 (2003))。这样，若基于其氨基酸序列与 OgLuc 的序列的比对，序列同一'丨生>30%,优选地>40%,和最优选地>50%,且蛋白可利用腔肠素作为底物以催化发光的发射，则蛋白为十足类荧光素酶。 [0405] 由于维持酶家族的特征性三维结构所必需的结构限制，酶家族中的氨基酸序列的一些部分表现出更高的量的保守(即，更高的序列同一性水平)。这样，这些保守的区域可用作两个蛋白之间共有的共同三维结构的另外的证据。保守的序列模式，也称作标记、模体或印迹，可通过本领域中已知的人工的或计算机的方法来生成。模式可见于公共数据库诸如 PROSITE (http: //expasy.0rg/prosite; Sigrist 等,Nucleic Acids Res.38 (增刊I):D161-D166(2010))。 [0406] 例如，保守的氨基酸的模式可在检查大量的已知FABP时发现。PR0SITE(发行 20.67，于2010年10月5日)包含FABP模式(登录号PS00214，构建于1990年4月，数据更新至2006年4月)。该FABP模式跨越18个氨基酸位置且如下所限定: [0407] [GSAIVK]-{FE}-[FYW]-χ-[LIVMF]-χ-χ-{K}-χ-[NHG]-[FY]-[DE]_x_[LIVMFY]-[LIVM]-{N}-{G}-[LIVMAKR ] (SEQ ID NO:329) (VI), [0408]其中: [0409].使用了氨基酸的标准IUPAC单字母密码子。 [0410].符号“χ”用于接受任何氨基酸的位置。 [0411] •通过在方括号“ □”之间列出氨基酸来指明位点处可选的氨基酸(例如，[ALT]代表该位置处Ala、Leu或Thr的可能性)。 [0412] •通过波形括号“{}”来指明位点出特定氨基酸的存在(例如，{AM}代表在位置处除Ala和Met外的任何氨基酸)。 [0413].每个序列位置(或模式中的元素)与其相邻通过而隔开。 [0414].每个序列位置被称作“模式位置”，例如[GSAIVK]将被认为是式(VI)的模式位置1，{FE}被认为是式(VI)的模式位置2，等。 [0415] 虽然保守的序列由于共同的潜在的三维结构所导致，可允许对于序列模式的一些不破坏三维结构的改变。例如，对于FABP家族的一些成员，在PR0SITE模式中的四个位点处发现了差异。FABP家族的这些另外的成员包括PR0SITE中所列的作为假阴性符合的5个蛋白，S卩，FABP模式不包括的FABP蛋白家族成员(UniProt数据库登录编号FBP12_HUMAN、FABP1_FASG1、FABP2_FASHE、FABPL_SCHB1、RET5_B0VIN)和已知具有 FABP 折叠的一个蛋白(蛋白数据库登录编号2A02)。虽然OgLuc与FABP共有密切相似的三维结构，天然的和变体的氨基酸序列的序列模式也轻微地不同，在5个位置与PR0SITE模式具有差异。在不同的实施方案中，OgLuc中的模式起始于对应于SEQ ID NO:1的第8位的位置。氨基酸置换、缺失或插入序列模式被计算为一个差异。 [0416] 联合来自这些另外的FABP和OgLuc变体的序列信息，可推导出改善的序列模式: [0417] [GSAIVK]-{FE}-[FYW]-χ-[LIVMFSYQ]-χ-χ-{K}-χ-[NHGK]-χ-[DE]-χ-[LIVMFY]-[LIVMWF]-χ-{G}-[LIVMAKRG](SEQ ID NO:330)(VII).[0418] 推导该模式所用的序列信息显示于表4中。第I列标识了模式位置(由N-末端到C-末端列出；模式长度为18个氨基酸)，和第6列标识了 OgLuc中对应的序列位置(根据SEQ ID NO:1来编号)。第2列显示了对于每个模式位置的PROSITE FABP模式(式(VI))元素。第3列列出了存在于FABP家族成员中的非PROSITE FABP模式所代表的氨基酸。第4列列出了存在于OgLuc (SEQ ID NO:1)或OgLuc变体中的未被PR0SITE模式所代表的氨基酸。第5列列出了通过将来自第2列、第3列和第4列的模式信息融合而构建的改良的模式("OgLuc模式”)(式(VII))。第7列列出了 OgLuc中对应于PROS I TE FABP模式位置的氨基酸。第8列列出了对应于改良的模式的位置处的甲藻荧光素酶序列(8个不同的物种)中发现的氨基酸(GenBank 登录号 2021262A、AAA68491、AAC36472、AAV35379、AAV35380、AAL40676, AAL40677, AAV35378, AAV35377, AAV35381 和蛋白数据库登录号 1VPR)。 [0419] 改良的模式(式(VII))用作FABP和OgLuc之间共有的三维蛋白结构的指示(SP，印迹)。然而，不需要与该模式的严格的一致来指示三维结构的共性。由此处所给出的例子，即使模式中存在多至5个改变，可存在共同的三维结构。同样，例如，即使甲藻荧光素酶与FABP和OgLuc具有相似的三维结构，其与改良的模式具有4个差异。 [0420] 这样，即使基于序列相似性和利用腔肠素来发光，可将蛋白识别为十足类荧光素酶，也可通过同时具有改良的序列模式对其进一步识别。特别地，若基于其氨基酸序列与SEQ ID NO:1或其变体的比对，序列同一性为>30%，优选地>40%，和最优选地>50%，且蛋白可利用腔肠素作为底物以催化发光的发射，且起始于对应于SEQ ID N0:1的第8位的位置的氨基酸序列为以下: [0421 ] [GSAIVK]-{FE}-[FYW]-χ-[LIVMFSYQ]-χ-χ-{K}-χ-[NHGK]-χ-[DE]-χ-[LIVMFY]-[LIVMWF]-χ-{G}-[LIVMAKRG](SEQ ID NO:330)(VII), [0422] 具有不超过5个差异，或更优选地不超过4个、3个、2个或I个差异，或更优选地无差异，其中差异发生在对应于根据表4的式(VII)的模式位置1、2、3、5、8、10、12、14、15、17或18的位置中，则蛋白为十足类荧光素酶。差异也可包括表4的模式位置之间的空位或插入。 [0423] 表4:蛋白序列模式 [0424] [0425] [0427] 实施例22——OgLuc变体的生成 [0428] 实验细节 [0429] 除非另外指明，具有随机置换的起始OgLuc变体序列的另外的变体利用易错的诱变的基于 PCR 的系统 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (Stratagene ；Daughtery, PNAS USA, 97 (5): 2029 (2000))根据制造商的说明和 NNK 位点饱和(Zheng等，Nucleic Acids Research, 32: el 15 (2004))来生成。 [0430] 起始OgLuc变体的具有特定的突变的另外的变体利用基于寡核苷酸的定点诱变试剂盒 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene;KunkeI, PNASUSA, 82 (2):488(1985))根据制造商的说明来生成。 [0431] 所得的变体在用于基于T7启动子的表达的pFIK FLEXI®:载体(Promega Corp.)的环境中构建。可选地，所得的变体在pF4Ag载体(商购可得的pF4A的形式(PromegaCorp.))的环境中构建，其包含经修饰而包含具有或不具有C-末端HALOTAG®(Promega Corp.;本文称作“HT7”)的大肠杆菌核糖体结合位点的T7和CMV启动子(Ohana等，Protein Expression and Purification, 68:110-120 (2009))以生成融合蛋白。例如，为获得C1+A4E变体，在pFIK载体背景中进行NNK饱和诱变实验。在不含HT7的pF4Ag载体背景中生成C1+A4E文库。在具有C-末端HT7的pF4Ag载体背景中生成QC27、QC27_9a和IVY文库。在不含HT7的pF4Ag载体背景中生成基于IV的变体。利用本领域中已知的技术将所得的载体用于转化KRX大肠杆菌。 [0432] 将生成的OgLuc变体关于在变体中所鉴定的氨基酸置换来命名和/或关于变体中所含的大肠杆菌克隆来命名，例如，图6A显示了，除其他所得外，大肠杆菌克隆16C5具有置换 Q20R。 [0433] 筛选细节 [0434] 将所得的文库在大肠杆菌中表达并利用自动化的系统初步筛选与对应的起始OgLuc变体相比较具有增高的光输出的OgLuc变体(即，增高的发光、增高的亮度或增高的光发射)或相对特异性的改变。所进行的自动化初始筛选如下:使用来自产生的文库的单独的克隆来接种96-孔平板中的最低限度培养基并在37°C下生长17至20小时(“Ml培养”)。利用新鲜的最低限度培养基1:20稀释Ml培养并在37°C下培养17-20小时(“M2培养”)。将M2培养1:20稀释到诱导培养基中并在走开诱导即自动诱导下在25°C下生长17-20小时(Schagat 等，“KRX Autoinduction Protocol: A Convenient Method for ProteinExpression.” Promega Notes, 98:16-18 (2008))。当新型腔肠素 PB1-3841、PB1-3842、PB1-3857、PB1-3880、PB1-3881、PB1-3886、PB1-3887, PB1-3897, PB1-3896 或 PB1-3894 在初始筛选中用作底物时诱导培养基含鼠李糖和葡萄糖。当天然腔肠素、已知的腔肠素_h或新型腔肠素PB1-3840、PB1-3889、PB1-3899或PB1-3900在初始筛选中用作底物时，诱导培养基不含鼠李糖或葡萄糖。根据C1+A4E和新型腔肠素之间生成的发光确定使用不同的诱导培养基，即，含鼠李糖和葡萄糖的诱导培养基与和其他新型腔肠素同C1+A4E相比较同C1+A4E生成较少的发光的新型腔肠素一起使用。 [0435] 将10 μ L的诱导的细胞利用含300mM HEPES pH8.0，300mM硫脲，0.3X被动裂解缓冲液(“PLB” ；Promega Corp.目录号 E194A)，0.3mg/mL 溶菌酶和 0.003U/μ L RQlDNA 酶的 60 μ L裂解缓冲液来裂解，并用含 150mM KCl、ImM CDTA、10mM DTT、0.5% TERGITOL NP-9 (v/v)的50 μ L测定缓冲液来测量发光，并利用20 μ M的天然的、已知的或新型腔肠素作为底物。在添加试剂后对每种变体进行3分钟发光测量并将相对发光单位值关于每个平板的对应的起始OgLuc变体的8个对照孔的平均值进行标准化。在TEC AN®自动化系统上完成测定。 [0436] 利用本领域中已知的标准测序技术对感兴趣的OgLuc变体进行测序以鉴定每个所述变体中的任何 添加的氨基酸置换。利用非自动化(人工)系统对感兴趣的变体克隆进行二级筛选。所进行的人工筛选如下:将变体克隆以三个重复生长于96-孔平板中，并使其表达，如关于自动化的测定所描述的进行测定，但测定缓冲液是利用多通道移液器人工添加的。对于每个变体，测量发光，将其平均并关于对应的起始OgLuc变体进行标准化。利用TECAN(B) INFINITE® F500光度计进行发光测量。 [0437] 确定相对特异性的改变 [0438] 通过用检验腔肠素底物存在下荧光素酶的发光除以参考腔肠素底物存在下荧光素酶的发光来确定相对底物特异性。例如，通过用利用本发明的新型腔肠素的荧光素酶的发光除以利用不同的腔肠素(例如，天然的或已知的腔肠素，或本发明的不同的新型腔肠素)的荧光素酶的发光来确定相对特异性。试验腔肠素底物和所比较的参考腔肠素底物被认为是用于确定相对底物特性的比较底物对。 [0439] 通过用利用比较底物对的试验荧光素酶的相对底物特异性除以利用相同的比较底物对的参考荧光素酶的相对底物特异性来确定相对底物特异性的改变。例如，通过用与不同的腔肠素(例如，天然的或已知的腔肠素或本发明的不同的腔肠素)相比较的本发明的新型腔肠素的试验荧光素酶的相对底物特异性除以与用于试验荧光素酶的相同的不同的腔肠素相比较的本发明的相同的新型腔肠素的参考荧光素酶的相对底物特异性来确定相对特异性的改变。 [0440] 将利用一种新型腔肠素的发光与利用不同的新型腔肠素的发光相比较。将利用一种天然的或已知的腔肠素的发光与利用另一天然的或已知的腔肠素的发光相比较。将利用一种天然的或已知的腔肠素的发光与利用新型腔肠素的发光相比较。[0441] 与对应的用于新颖腔肠素的起始OgLuc模板相比较OgLuc变体的发光(RLU)的增高和参考腔肠素的发光的降低或无变化表示相对特异性的改变。与对应的起始OgLuc相比较新型和参考的腔肠素二者的OgLuc变体的发光的降低，而利用新型腔肠素的OgLuc变体的发光更多的降低，也表示相对特异性的改变。与对应的用于新型和参考的腔肠素的起始OgLuc相比较OgLuc变体的发光的增加表明活性/稳定性/表达的提高。若关于新型和参考的腔肠素二者的OgLuc变体的发光提高，而关于新型腔肠素的发光的提高更高，表明OgLuc变体的相对特异性的增高和活性/稳定性/表达的改善。 [0442] A.C1+A4E 变体 [0443] 将先前在美国申请第12/773，002号(美国公开申请第2010/0281552号)中描述的C1+A4E(SEQ ID NO:2和3)用作生成另外的合成的OgLuc变体的基本起始序列(即，亲代序列)。C1+A4E相对于SEQ ID NO:1具有以下的氨基酸置换:A4E、QlIR、A33K、V441、A54F、P115E、Q124K、Y138I和N166R。利用实施例1_14中所描述的新型腔肠素(关于例子参见图4)作为底物，如先前所描述的测量含细菌裂解物的C1+A4E的发光并与利用天然的和已知的腔肠素作为底物的发光(图5A-G)相比较。图5A显示了利用天然腔肠素(“腔肠素”)、已知的 PB1-3880 和新型腔肠素 PB1-3842、PB1-3857、PB1-3881、PB1-3882,PB1-3886和PB1-3887作为底物C1+A4E的发光。将利用已知的和新型的腔肠素的发光测量光域利用天然腔肠素的C1+A4E的发光标准化并与天然腔肠素比较倍数降低(图5B)。图5C-E分别显示了利用天然腔肠素和新型腔肠素PB1-3945、PB1-3894和PB1-4002的C1+A4E的发光。图5F显示了利用天然腔肠素和新型腔肠素PB1-3840、PB1-3897、PB1-3889、PB1-3899和PB1-3900的C1+A4E的发光。图5G显示了利用天然腔肠素、已知的腔肠素PB1-3912和新型腔肠素 PB1-3913、PB1-3925、PB1-3939、PB1-3933、PB1-3932、PB1-3946、PB1-3841 和PB1-3896的C1+A4E的发光。数据表明C1+A4E变体可利用新型腔肠素中的每一种作为底物。 [0444] 除非另外指明，生成的C1+A4E变体具有至少在C1+A4E中所鉴定的氨基酸置换。通过如先前所描述的随机诱变生成C1+A4E的4400变体克隆的文库(文库I)并如先前关于相对特异性改变和/或活性改变(例如，亮度)的改良所描述的进行筛选。利用天然腔肠素、已知的腔肠素_h(已知的PB1-3880)和新型腔肠素PB1-3840、PB1-3841、PB1-3842、PB1-3857、PB1-3881、PB1-3886、PB1-3887、PB1-3889、PB1-3897 和 PB1-3900 作为底物初步筛选变体。此外，利用新型腔肠素PB1-3896和PB1-3894作为底物筛选一半的变体。选择包含具有从筛选先前的新颖化合物所鉴定的已知的感兴趣的突变的变体的平板。分离在初步筛选试验中关于所试验的一种或多种新型腔肠素表现出改良(相对特异性改变或活性改变)的变体，进行测序并在二级筛选中进行筛选。 [0445] 在二次人工筛选中，利用已知的腔肠素PB1-3912、腔肠素-h、腔肠素-hh、2_甲基腔肠素和腔肠素 V ;和新型腔肠素 PB1-3840、PB1-3897、PB1-3889、PB1-3899、PB1-3900、PB1-3925、PB1-3944、PB1-3932、PB1`-3945、PB1-3913 和 PB1-3896 作为底物对变体进行试验。图6A-D总结了变体的关于C1+A4E标准化的平均发光(“克隆”)。图6A-D总结了这些变体中的置换(“氨基酸序列”)，其具有以下的添加的氨基酸置换中的至少一项:A14V、G15R、Q18L、Q20R、L221、E23K、L27V、L27M、K33N、T391、E49K、F54S、F541、D55G、I56V、V581、V58L、I59T、S66T、G67S、F68S、L72Q、M75K、I76N、F77T、F77C、K89E、I90V、I90T、L92H、H93R、M106K、Y109F、P113T、I117F、T126R、V127A、L136M、D139G、P145L、S148T、C164S 或 A169V。 [0446] 如图6A-C中所示，第54、92和109位的氨基酸置换是感兴趣的，因为这些位置的置换提供了更高的光输出或改良的相对特异性，即，特异性与天然腔肠素差距远且接近至少一种新型腔肠素(如图6A-C所示的)。克隆29H7中的氨基酸置换F54I利用天然腔肠素和新颖腔肠素中的一些提供了更高的光输出。克隆40H11中的氨基酸置换Q18L、克隆04A12中的氨基酸置换L92H，和克隆43F9中的氨基酸置换Y109F提供了改良的相对特异性。 [0447] 表5列出了如先前所描述的生成的在第77、92或109位具有另外的氨基酸置换(“氨基酸改变”)的C1+A4E变体。如先前所描述的分析这些变体的增高的光输出，即，利用天然腔肠素，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3939、PB1-3894、PB1-3896、PB1-3897、PB1-3932或PB1-3925作为底物筛选比C1+A4E至少1.3X亮的变体。以下的另外的置换产生比 C1+A4E 至少 1.3 X 亮的变体:L92G、L92Q、L92S、L92A、L92M、L92H、L92Y、F77W、F77Y、F77S、F77T、F77V,、F77A、F77G、F77C、F77D、F77M 和 Y109F。如表 5 中所示，L92H、F77W 和F77A置换利用PB1-3897、PB1-3896和PB1-3932具有最显著的改良。 [0448] 表5:第77、92和109位的位点饱和 0450] 如先前所描述的通过定点诱变生成另外的C1+A4E变体(Α组)以在以下氨基酸位置的至少一个中相对于SEQ ID NO:1具有另外的置换:18、20、54、59、72、77、89、92、109、113、127、136或164。选择这些氨基酸位置是因为,基于文库I的初级筛选和二级筛选,这些位置处的置换与C1+A4E相比较利用以下中的至少一种作为底物具有增高的总体光输出:新型腔肠素 PB1-3841、PB1-3896、ΡΒΙ-3897、ΡΒΙ-3894、ΡΒΙ-3925 或 ΡΒΙ-3932 或已知的腔肠素2-甲基腔肠素或ΡΒΙ-3912。图7列出了每个变体中所含的变体(“克隆”)和另外的氨基酸置换。如先前所描述的如关于二级人工筛选所描述的以三个重复测定变体克隆并关于C1+A4E标准化。图8Α-Β和9显示了图7中所列的变体利用不同的腔肠素作为底物的标准化的平均发光。图8A-B和9显示了与C1+A4E相比较所列的新型化合物的发光的较大的增加或与C1+A4E相比较已知腔肠素的发光的无改变或降低。克隆QC27，其具有另外的氨基酸置换Q18L、F541、L92H和Y109F，与C1+A4E相比较利用PB1-3896的发光具有561.32倍数增加，利用PB1-3894具有392.98倍数增加，和利用PB1-3896具有283.85倍数增加。该数据显示了 Q18L、L92H和Y109F可互相组合和具有另外的置换以产生具有改良的相对特异性的变体。 [0451] 将从文库I鉴定的感兴趣的其他置换组合以生成另外的变体(B组)(图10)。在以下氨基酸位置中的至少一个中相对于SEQ ID N0:1进行另外的氨基酸置换:18、20、54、71、77、90、92、109或127。这些置换显示了利用以下新型腔肠素中的至少一个作为底物的改良:PB1-3841、PB1-3896、PB1-3897, PB1-3894, PB1-3925 或 PB1-3932。利用天然腔肠素、已知的腔肠素 _hh 和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3840、PB1-3932、PB1-3925、PB1-3894和PB1-3896如关于A组变体所描述的对这些变体进行测定。如先前所描述的如关于二级人工筛选所描述的以三个重复测定变体克隆并关于C1+A4E标准化。图11显示了利用不同的腔肠素作为底物的图10所列的变体的标准化的平均发光。图11显示了与C1+A4E相比较所列的新型腔肠素的发光的大量增加或与C1+A4E相比较天然的和已知的腔肠素的发光的无变化或降低。 [0452] 利用另外的氨基酸置换I90V和/或Y109F生成另外的变体(C组)并与从A组或B组生成的变体相比较(参见图12)。利用天然腔肠素、已知的腔肠素_hh和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889、PB1-3840、PB1-3925、PB1-3932、PB1-3894、PB1-3896 和PB1-3897作为底物利用如关于A组重组体所描述的测定将包含具有I90V置换(“I90V”)、Y109F置换(“Y109F”)或两种置换(“LE2”)的变体的克隆与克隆QC#27、QC#2E7、QC#2F4和QC#1A11相比较(图12)。如先前所描述的如关于二级人工筛选所描述的以三个重复测定变体克隆并关于C1+A4E标准化(图12)。图12显示了与C1+A4E相比较所列的新型腔肠素的发光的大量增加和与C1+A4E相比较天然的或已知的腔肠素的发光的无变化或降低。图12显示了 I90V为天然腔肠素和新型底物中的一些提供了较高的光输出。 [0453] B.QC27 变体` [0454] 如先前所描述的将来自A的具有另外的氨基酸置换Q18L、F541、L92H和Y109F的变体QC27 (SEQ ID N0:4和5)克隆到pF4A修饰的载体中以构建C-末端HT7 (PromegaCorp.)融合蛋白(“QC27-HT7”)(SEQ ID N0:44和45)。如先前所描述的通过随机诱变生成QC27-HT7的4400个变体(文库2)，并利用天然腔肠素和新型腔肠素PB1-3896和PB1-3897作为底物如先前所描述的对增高的相对特异性改变进行初级筛选。利用天然腔肠素、已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3897、PB1-3896和PB1-3894作为底物在二级人工筛选中选择变体克隆，进行测序和测定。 [0455] 图13列出了这些变体(“样品”)中所鉴定的另外的氨基酸置换(“序列”)，和在二级筛选中利用天然腔肠素，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3897、PB1-3896和PB1-3894作为底物变体的关于对应的起始QC27-HT7标准化的发光。图14中的变体，具有以下的另外的氨基酸置换中的至少一种:F11、R11Q、L181、L18Q、V21L、V21M、L22F、F311、Q32H、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D、G51E、D55E、G67S、F68Y、F68L、Q69H、L72Q、E74K、E741、M75K、I76F、I76V、H86R、I90T、H92Q、H92R、T96A、V98F、I99V、I99T、V102M、M1061、F109Y、L142V、V1581、T159S、L168F 或 G170R(G170R 位于 HT7 和 OgLuc 变体之间的接头区域)。 [0456] 变体24B12中的氨基酸置换F68Y、变体29C4中的L72Q和变体3H11中的M75K各为天然腔肠素和新型底物中的一些提供了较高的光输出。变体25A11中的氨基酸置换V21L和变体1B6中的H92R提供了增高的相对特异性。该两种置换是利用新型腔肠素作为底物发光信号降低，但利用天然的和已知的腔肠素作为底物降低更多的情况。 [0457] 如先前所描述的利用定点诱变生成了另外的QC27-HT7变体以具有特定的氨基酸置换(图14)。在相对于SEQ ID NO:1的以下氨基酸位置中的至少一个生成了另外的置换: 21、68、72、75、76、90、92和158，由于这些位置显示了如图14中所示的相对特异性改变的增高。图15显示 了利用天然腔肠素、已知的腔肠素-hh和新型腔肠素PB1-3897、PB1-3841、PB1-3896和PB1-3894作为底物QC27-HT7变体的关于对应的起始QC27-HT7标准化的发光。如图15中所见，将三种氨基酸置换F68Y、L72Q和M75K与V158I相组合，如变体QC27#1中所示例的，对于所试验的每种腔肠素提供了更高的光输出。 [0458] C.QC27-9a 变体 [0459] 使用来自B的变体QC27_9a(SEQ ID NO:6和7)，即具有另外的氨基酸置换V21L、H29R、F68Y、L72Q、M75K和V158I的QC27-HT7融合蛋白，作为起始序列来生成文库。如先前所描述的通过随机诱变生成QC27-9a的4400个变体(文库3)并利用天然腔肠素和新型腔肠素PB1-3841和PB1-3897筛选增高的相对特异性改变。利用天然腔肠素，已知的腔肠素_hh，已知的腔肠素-h和新型腔肠素PB1-3841和PB1-3897作为底物如先前所描述的在二级人工筛选中选择变体克隆，进行测序和测定。图16列出了在变体(“样品”)中鉴定的另外的置换(“氨基酸改变”)，和在二级筛选中利用天然腔肠素、已知的腔肠素_hh，已知的腔肠素_h和新型腔肠素PB1-3841和PB1-3897作为底物变体的关于对应的起始QC27_9a的平均发光。相对特 异性的增高代表着与起始模板相比较利用新型、天然的和已知的腔肠素变体的发光降低，但利用天然的和已知的腔肠素发光降低得更多的情况。例如，具有氨基酸置换L22F的变体30D12利用新型腔肠素PB1-3841和PB1-3897具有约三倍的活性丧失。然而，利用天然腔肠素，已知的腔肠素_h和已知的腔肠素-hh，变体30D12的发光降低了 10倍或更多。 [0460] 图17显示了利用天然腔肠素，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3841和PB1-3897作为底物与人源化的海肾属荧光素酶(本文称作“hRL”)(SEQ ID NO:30和31)相比较C1+A4E、QC27-HT7和QC27_9a的发光。虽然利用PB1-3897的QC27_9a的反应比利用PB1-3841的QC27-9a更亮(参见图17)，演变趋势，S卩，发光的增大的强度，关于PB1-3841是最高的(表6)。将天然腔肠素的发光的增大(440倍)和发光的降低(800倍)相组合，表明了与天然腔肠素相比较利用PB1-3841QC27-9a的相对特异性的改变(350，000倍)。 [0461] 表6:与天然腔肠素和腔肠素_hh相比较关于PB1-3897和PB1-3841的OgLuc变 体的相对特异性的改变 [0462]化合物 演变趋勢:相对特异性的改变《新《腔it素/灭然腔農 (ΊΛ4Ε 至 Q07#% 素) 腔肠素 下降X(M)X 歲騰素-Mi 下降3ϋ()Χ PB1-3897 Ji升 IOOX ΧΟ,ΟΟΟΧ PB1-3841 上升 440X 350,000X [0463] D.1VY 变体 [0464] 如先前所描述的将IVY (SEQ ID NO: 8和9)，具有另外的氨基酸置换F541、I90V、和F77Y的C1+A4E变体克隆到pF4A修饰的载体中以构建C-末端HT7融合蛋白(“IVY-HT7”)。通过随机诱变生成IVY-HT7的4400个变体(文库4)并利用天然腔肠素，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3840、PB1-3889、PB1-3925、PB1-3932和PB1-3945作为底物筛选增高的光输出(即，增高的亮度)和增高的相对特异性。利用天然腔肠素，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3889、PB1-3939、PB1-3945和PB1-4002作为底物如先前所描述的在二级筛选中以三个重复选择变体克隆，进行测序和测定。图18和19列出了在变体(“样品”)中鉴定的另外的置换(“氨基酸改变”)和在二级筛选中了天然腔肠素，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3889、PB1-3939、PB1-3945和PB1-4002作为底物变体的关于IVY-HT7的平均的发光。图18列出了根据利用PB1-3945的表现选择的那些变体(A组)，其具有以下氨基酸置换中的至少一种:Q18H、D19N、Q20P、Q32P、K33N、V381、V38F、K43N、I44F、E49G、I60V、Q69H、I76N、Y77N、Y94F、G95S、G95D、F1101、V119M、K124M、L149I 或 R152S。图 19 列出了根据利用PB1-3889的表现选择的那些变体(B组)，其具有以下氨基酸置换中的至少一种:F6Y、Q18L、L27V、S28 Y、Q32L、K33N、V36E、P40T、Q42H、N50K、G51R、H86L、N135D 或 I155T。 [0465] 如先前所描述的利用定点诱变生成了另外的具有另外的氨基酸置换的IVY-HT7。图20列出了相对于SEQ ID NO:1具有以下另外的氨基酸位置中的至少一项的变体:19、20、27、32、38、43、49、58、77、95、110和149，因为这些置换在图18的变体中被鉴定，其显示了接近PB1-3945和PB1-4002的特异性。图21显示了图20中所列的变体利用天然腔肠素，已知的腔肠素_h，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3939、PB1-3945、PB1-4002、PB1-3932和PB1-3840作为底物关于IVY-HT7标准化的发光。无变体显示超越IVY-HT7的增高，但存在例子——诸如变体C5.19 (SEQ ID NO: 12和13)其利用天然的或已知的腔肠素的发光降低了约3-41og，但利用PB1-3945和PB1-4002的发光仅降低了两倍。变体C5.19具有另外的氨基酸置换L27V、V38I和L149I。 [0466] 图22列出了相对于SEQ ID NO:1具有以下增加的氨基酸位置的至少一种:6、18、27、28、33、34、36、40、50、51、135和155，因为这些置换在图19的变体中被鉴定，其显示了接近PB1-3889和PB1-3939的特异性。图23显示了图21中所列的变体利用天然腔肠素，已知的腔肠素-hh 和新型腔肠素 PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889、PB1-4002、PB1-3932 和PB1-3840作为底物并关于IVY-HT7标准化的发光。与IVY-HT7相比较每种变体的发光降低。利用PB1-3939的变体Cl.3(SEQ ID N0:10和11)比利用天然的或已知的腔肠素具有约2000倍更高的发光。变体Cl.3具有另外的氨基酸置换F6Y、K33N、N13®和I155T。 [0467] 与hRL和IVY-HT7相比较相对特异性改变的最佳IVY-HT7变体是C5.19，其利用PB1-3945具有最佳的发光，以及(:1.3，其利用？81-3889具有最佳的发光。图24显示了利用天然腔肠素，已知的腔肠素-h,已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3939和PBI_3945hRL、IVY-HT7、C5.19 (C-末端HT7融合体)和Cl.3 (C-末端HT7融合体)的发光。 [0468] Ε.1V 变体 [0469] 如先前所描述的生成IV(SEQ ID NO: 14和15)，即具有另外的氨基酸置换F54I和I90V的C1+A4E变体。为确定用作转录报告子的最亮的变体，利用天然腔肠素，已知的腔肠素和新型腔肠素PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889和PB1-4002作为底物如先前所描述的测量 C1+A4E(SEQ ID NO: 2 和 3)、IVY (SEQ ID NO: 8 和 9)和 IV (SEQ ID NO: 14 和 15)提供的发光。hRL用作对照。如图25中所见，IV比C1+A4E和IVY两者更亮。IV中的氨基酸置换F54I对于天然腔肠素和新型底物中的一些提供了更高的光输出。利用试验的腔肠素全部三种变体比hRL更亮。 [0470] 综合来自A、B和D(即，从作为起始序列的C1+A4E、IVY和QC27生成的文库的筛选)的数据以确定利用多种腔肠素具有增高的光输出(即，增高的亮度)的那些另外的氨基酸置换。如先前所描述的生成具有对于天然腔肠素具有两倍至十倍的降低的特异性的另外的置换的IV变体。如图26中所列出的，IV变体(“克隆”)具有以下氨基酸置换中的至少一种的另外的氨基酸置换(“序列”):F11、E4K、Q18L、L27V、K33N、V381、F68Y、M70V、L72Q、M75K 或 V102E。 [0471] 对氨基酸置换的全部组合的16个平板的变体克隆进行初级筛选并利用天然腔肠素，已知的腔肠素_h，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3889和PB1-3945作为底物如先前所描述的利用自动化的机器人方法进行测定。如先前所描述的利用人工筛选以三个重复选择具有改良的发光的变体，进行测序和测定。利用天然腔肠素，已知的腔肠素_h，已知的腔肠素_hh和新型腔肠素PB1-3889`、PB1-3939、PB1-3945和PB1-4002作为底物测量发光。使用对应的起始序列IV和hRL作为对照。 [0472] 图26列出了变体，和在变体中鉴定的另外的氨基酸置换。图27显示了二级筛选中的变体关于IV标准化的平均发光。变体8A3(SEQ ID NO: 26和27)，其具有另外的氨基酸置换F11、L27V和V38I，利用新型腔肠素具有增高的相对特异性，但不如IV更亮。变体8F2 (SEQ ID NO: 46和47)，其具有另外的氨基酸置换L27V，利用所用的4个新型腔肠素中的3个提供了增高的相对特异性和亮度。变体9B8(SEQ ID NO: 18和19)，其具有另外的氨基酸置换Q18L、F68Y、L72Q和M75K，比所有底物更亮且还提供了超越天然腔肠素的一些相对特异性优点。变体9F6(SEQ ID NO: 20和21)，其具有另外的氨基酸置换Q18L、L27V、V381、F68Y、L72Q和M75K，显示与利用8F2所见的相似的增高。变体15C1 (SEQ ID N0:16和17)，其具有另外的氨基酸置换E4K、K33N、F68Y、L72Q和M75K，其对于全部新型腔肠素更亮，但不具有任何提高的相对特异性益处。在IV的情况下，变体1D6中的氨基酸置换Q18L提供了增高的相对特异性，即，与天然腔肠素差距远并接近新型底物。总之，氨基酸置换L27V在IV的情况下提供了相对特异性。 [0473] 图28显示了与IV和hRL相比较，利用天然腔肠素，已知的腔肠素_hh，已知的腔肠素_h和新型腔肠素PB1-3939、PB1-3945、PB1-3889和PB1-4002作为底物二次筛选中8A3、9B8、9F6和15C1的发光。利用天然腔肠素变体8A3与IV相比较亮度具有21og降低。利用天然腔肠素变体9F6与IV相比较亮度具有Ilog降低。利用PB1-3945的变体15C1是最亮的，但信号半衰期短(参见实施例27)。 [0474] F.9B8 变体 [0475] 对来自E的9B8变体进一步修饰以生成具有增高的光发射和/或对于PB1-3939增高的相对特异性的另外的变体。氨基酸置换L72Q表现为对于增高的光发射(即，亮度)的有利的氨基酸置换，因为在变体9B8、9F6、和15C1中鉴定了该置换，其均显示了增高的光发射。为确定第72位的其他氨基酸置换是否将提供相似的亮度增加，通过用可替换的残基使第72位饱和如先前所描述的生成9B8的另外的变体。制备大肠杆菌裂解物的四个重复并利用PB1-3939作为底物如先前所描述的关于亮度进行分析，但不同的是测定缓冲液含 10mMCDTA、150mM KClUOmM DTTUOOmM HEPES, ρΗ7.0、35mM 硫脲和 0.5% TIZRCHTOLS:NP-9 (v/v)。表7列出了如通过关于9B8标准化的发光(“RLU(关于9B8标准化)”)所表明的，与9B8相比较具有相似的或增高的发光的9B8变体(“变体”)，即，倍数增高。第72位的氨基酸置换A、G、N、R和M提供了与氨基酸Q至少相同的亮度益处，即，I倍。 [0476] 表7:与变体9B8相比较具有相似的发光的变体。 [0477] [0478] 通过使变体9B8中的第18、68、72、75和90位氨基酸饱和，如先前所描述的生成对新型PB1-3939具有增高的相对特异性的另外的变体。制备大肠杆菌裂解物并利用天然腔肠素和新型PB1-3939作为底物如先前所描述的关于亮度进行分析。关于对应的9B8的发光标准化，从利用PB1-3939的变体的发光与利用新型腔肠素的变体的发光的比率确定相对特异性。表8列出了具有对于PB1-3939至少1.1X倍增加的相对特异性的9B8变体(“变体”)。结果表明在每个位点的至少一个另外的改变相比天然腔肠素对于PB1-3939提供了相对特异性。在第18位具有氨基酸置换K、D、F、G、Y、W和H的9B8变体具有相对特异性的最高的倍数增加。 [0479] 表8:具有对于PB1-3939增高的相对特异性的变体 [0480] 9B8 I Q72T U 9B8 + Q72N U 9B8 i Q72R 1.7 9B8 + Q72P IM 9B8 I Q72G U 9B8 I Q72A 1.4 9B8 I Q72M L3 9B8 丨 Q72C L3 9B8 I Q72H L2 9B8 I Q72S 12 9B8 + M75F L2 9B8 + V90R 24 9B8 + V90Y L6 9B8 f V90D 14 9B8 i V90P 1,4 9B8 I V90K 1,3 9B8 I V90Q 1,2 [0482] G.9B8+K33N 变体 [0483] 生成了另外的变体，9B8opt+K33N(SEQ ID NO:42和43)以研究氨基酸置换K33N对于亮度、相对特异性和热稳定性的益处。在不同的应用中检查9B8opt+K33N并与9B8opt相比较(实施例25A中所描述的)。 [0484] 制备含变体9B8opt或9B8opt+K33N的大肠杆菌裂解物并如先前所描述的进行分析，不同的是测定缓冲液含0.1% TERGITOL B: NP-9(v/v)。利用新型PB1-3939和天然腔肠素作为底物测量从裂解物生成的发光。如先前所描述的计算变体对于ΡΒΙ-3939和天然腔肠素的相对特异性。与9B8opt相比较9B8opt+K33N( “K33N”)具有比天然腔肠素更高的光输出(RLU)和对于PB1-3939更高的相对特异性(图29)，表明K33N置换提供了更高的光输出和增高的相对特异性。 [0485] 利用9B8opt+K33N作为起始模板构建了新型的OgLuc文库。利用DIVERSIFY®PCR Random Mutagenesis Kit (ClonTech ；目录号 #630703)构建了随机的文库。使用了条件5 (如用户手册中所列的 )来生成另外的变体,通过将来自83个随机选择的克隆的序列数据计算平均突变为2.6突变每基因。如先前所描述的将该PCR文库克隆到基于pF4Ag的非融合的载体背景和三明治背景中，即，Id-0gLuc-HT7 (实施例45中所描述的)。基于pF4Ag的非融合载体背景命名为(NF)。三明治载体背景中的变体命名为(F)。为将PCR产物克隆到两种载体中，将氨基酸，即，甘氨酸，附着于pF4Ag中的变体序列中，在OgLuc变体中生成了新的第170位(“170G”)。该170G存在于三明治构建体中，但在该情况中被认为是OgLuc和HT7之间的接头的部分。对于每个文库，除以下不同如先前所描述的测定4，400个大肠杆菌克隆。裂解缓冲液含 300mM MES pH6.0 而非 HEPES，以及 0.5% TERGITOL® NP-9 (v/V)，但不含硫脲。测定缓冲液含IOOmM MES pH6.0而非HEPES，和35mM硫脲。该测定体积如T =IOuL细胞，40 μ L裂解缓冲液和50 μ L测定缓冲液。 [0486] 关于与9B8opt+K33N+170G(SEQ ID NO:68和69)相比较具有增高的发光的另外的变体筛选基于pF4Ag的非融合的背景中的PCR文库。然后在HEK293细胞和NIH3T3细胞中测定所选择的变体。对于每种细胞类型，接种15，000个细胞并在37°C下过夜生长。第二天，利用IOng pGL4.13 (Promega Corp.)如实施例25中所描述的转染细胞作为转染对照，并用IOOng的OgLuc试验DNA转染细胞。去除培养基，并如实施例25中所描述的用100 μ L的裂解缓冲液裂解细胞，但不同的是裂解缓冲液含IOOmM MES ρΗ6.0而非HEPES，并利用GLOMAX® Luminometer测量发光。对于每个样品，利用含20 μ ΜΡΒΙ-3939的50 μ L裂解缓冲液测定ίο μ L的裂解物。对于转染对照，用50 μ L的BRIGHT-GL0™测定试剂测定10 μ L的裂解物。 [0487] 表9显示了大肠杆菌、ΗΕΚ293和ΝΙΗ3Τ3细胞中的变体的发光的倍数增加和变体中发现的氨基酸置换。变体 27Α5 (NF) (SEQ ID NO:70 和 71)，23D4(NF) (SEQ ID Ν0:72 和 73)和24C2(NF) (SEQ ID NO:74和75)在大肠杆菌细胞和HEK293细胞中具有发光的至少1.3倍增加。 [0488] 表9:在大肠杆菌细胞、HEK293细胞和NIH3T3细胞中与9B8opt+K33N+170G相比较由OgLuc变体所生成的发光的增加 [0489] [0490] 基于以上数据，设计并在无170G的基于pF4Ag的非融合载体背景的环境中生成了其他组合变体(见表10)。如以上所描述的在大肠杆菌细胞、HEK293细胞和NIH3T3细胞中分析了变体并与9B8opt+K33N相比较。检查了利用天然腔肠素的变体的发光。表10显示了大肠杆菌细胞、HEK293细胞和NIH3T3细胞中变体的发光，和变体中(“样品”)发现的氨基酸置换。通过将变体中的另外的氨基酸置换添加到前缀“9B8opt+K33N.”来命名变体。表11显示了在大肠杆菌细胞、NIH3T3细胞和HEK293细胞中与天然腔肠素相比较不同的变体对于 PB1-3939 的相对特异性。如图 10 中所示，变体 9B8opt+K33N+T39T+K43R+Y68D (“V2”;SEQID NO:92和93)在大肠杆菌中具有增高的发光且在NIH3T3细胞中具有发光的轻微增高。 在所检查的三个细胞类型中，变体9B8opt+K33N+L27V+K43R+Y68D (“L27V、K43R、Y68D”)具 有发光的中性的增高(表10)和超越9B8opt+K33N的5X倍数增加的相对特异性(表11)。 [0491]表10:在大肠杆菌细胞、NIH3T3细胞和HEK293细胞中与9B8opt+K33N相比较由 OgLuc组合变体生成的发光的增加 [0492] [0493] 表11:在大肠杆菌细胞、NIH3T3细胞和HEK293细胞中与天然腔肠素相比较OgLuc 组合变体对于PB1-3939的相对特异性的改变 [0494] [0500] H.V2 变体 [0501] 利用V2作为模板(具有另外的氨基酸置换K33N+T39T+K43R+Y68D的9B8opt)设计了一套另外的变体。基于I)根据28种脂肪酸结合蛋白的基于结构的比对已知的多样性(1VYF、1FDQ、2A0A、108V、IBffY,2ANS,1VIV、IPMP,1FTP、2HNX、IJJJ、1CBR、2CBS、1LPJ、1KQW、2RCQ、1EI1、1CRB、1IFC、2PY1、2JU3、1MVG、2Q04、1P6P、2FT9、1MDC、101U、1E10 ;参见美国公开申请第2010/0281552号)，或2)对先前已鉴定的位置处的可选的残基在底物特异性中起作用的探查设计了表13中所示的置换。表13中的“共有序列”下所列的改变涉及在经比对的、上述的脂肪酸结合蛋白的至少50%中所鉴定的残基。“主要的少数”下所列的改变涉及在上述的脂肪酸结合蛋白的多数中所鉴定但发现于对齐序列的50%以下的残基。“其他”下所列的改变涉及比在对齐的序列中给定的位置处的主要的少数残基频率更低的残基。最后，“特异性”下所列的改变涉及推测参与决定变体对于腔肠素或腔肠素类似物的特异性的位置有关。例如，第27位处(亲代序列中的亮氨酸残基，即，V2)所设计的特异性改变为变为其他疏水性残基或代表替代的化学的氨基酸(例如，包含环的疏水性残基，包含无电荷极性侧链的残基，或包含带电荷的侧链的残基)；和第40位处(亲代序列中的脯氨酸)所设计的特异性改变为对不同的化学的选择(化学(例如，包含环的其他疏水性残基，包含无电荷极性侧链的残基或包含带电荷的侧链的残基)；注意甘氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和亮氨酸在该位置中被鉴定为对齐的脂肪酸结合蛋白)。 [0502]表 13 [0503] [0504] 利用标准的定点诱变方案(参见先前的例子)构建变体，并将所得的质粒转化到大肠杆菌中以用于分析。如先前所描述的在最低限度培养基中按照标准的走开诱导使培养生长。向10 μ L的培养的转化的大肠杆菌细胞中先后添加40 μ L裂解缓冲液(IOOmMMES pH6.0,0.3XPLB, 0.3mg/mL 溶菌酶，0.003U/ μ L RQlDNA 酶 I 和 0.25% NP-9 (v/v))和等体积(50 μ L)的测定缓冲液(ImMCDTA，150mM KCl, 2mM DTT,20yMPB1-3939 或天然腔肠素，IOOmM MES pH6.0, 35mM 硫脲和 0.5% NP-9 (v/v))。在 96Microplate Luminometer (Promega Corp.)上测量发光。 [0505] 表14总结了在分析中鉴定的不同的氨基酸置换。数据呈现为关于亲代克隆(V2)关于对于PB1-3939和天然腔肠素所测量的发光标准化。还显示了对PB1-3939的特异性关于天然腔肠素的相对改变。 [0506] 表 14 [0507] [0508] 1.L27V 变体 [0509] 利用OgLuc变体L27V作为起始模板，即，起始序列或亲代序列，生成了另外的变体，其中将L27V变体中的氨基酸的一些(表15)回复为在SEQ ID NO:1的天然的OgLuc荧光素酶中发现的氨基酸。如先前所描述的通过定点诱变构建变体。然后如先前所描述的利用天然腔肠素或PB1-3939筛选变体的相对活性。在添加底物/测定试剂(如在H中所描述的)之后5分钟在TECAN® INFINITE® F500上测量发光并关于L27V变体起始 模板进行标准化。裂解物的SDS-PAGE分析表明了类似的表达水平(数据未示出)。 [0510] 表15显示了利用天然腔肠素或PB1-3939L27V变体的相对活性。相对活性〈I表明与L27V变体中的该位点处的残基相比较回复是有害的。相对活性>1表明与L27V变体中的该位点的残基相比较回复对于活性是有利的。这些突变体的一些另外的数据表明了以下:检验了 166K、54F、54A 和 L27V 的热稳定性。166K、54F 和 54A 的 T1/260°C分别为 87、74和33%，表明这些置换导致了热稳定性的降低。该相同的4个变体的Km值为以下:对于天然腔肠素，L27V 为 16 μ M，54Α 为 23 μ M、54F 为 40 μ M 和 166Κ 为 21 μ M ;对于 ΡΒΙ-3939，L27V为18yM、54A*62yM、54FS 163 μ M和166Κ*23μΜ。这表明了 L27V的较高的底物亲和力，尤其是关于第54位的置换。 [0511]表 15 [0512] [0513] [0514] 实施例23——第166位的突变分析 [0515] Α.为评价第166位的不同的氨基酸对荧光素酶活性的作用，如先前所描述的在pF4Ag载体的环境中(即，在野生型OgLuc序列SEQID NO:1的环境中)将第166位的精氨酸(R)残基置换为其他19个氨基酸中的每一个。然后如先前所描述的在大肠杆菌中表达这些第166位变体。 [0516]为构建裂解物，将 50 μ L0.5Χ FASTBREAK™Cell 裂解试剂(Promega Corp.)添加到950 μ I的诱导的培养中，并将混合物在22°C下孵育30分钟。为了分析，利用100 μ MPB1-3939、30 μ M天然腔肠素或22 μ M腔肠素_h在50 μ L的测定试剂(如先前在实施例22Η中所描述的)中测定50 μ L的裂解物。如先前所描述的测量发光(图30A-C)。图30A-C显示了 Ν166突变体的相对特异性。蛋白质印迹分析确定了全部变体的相似的表达(数据未示出)。 [0517] B.在野生型OgLuc或N166R背景中评估了特定的单独的氨基酸置换L27V、Α33Ν、K43R、M75K、T39T、L72Q和F68D。如先前所描述的通过定点诱变生成了单独的氨基酸置换，如先前所描述的在大肠杆菌中表达并用22 μ M天然腔肠素利用测定试剂测量发光(如先前在实施例22H中所描述的)(图30D)。蛋白质印迹分析确定了所有变体的相似的表达(数据未不出)。 [0518] 实施例24——缺失变体 [0519] 按照以下对L27V变体生成缺失: [0520] 表 16 [0521] [0522] OgLuc变体L27V的N-末端是蛋氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，即MVF。为编号的目的，认为苯丙氨酸是第一氨基酸，“Val-Ι”表示“MVF”中的缬氨酸被缺失。“MVF”的蛋氨酸包含于这些缺失中。将L27缺失变体克隆到pF4Ag载体中如先前所描述的在大肠杆菌KRX细胞中表达。如所描述的进行诱导和裂解物制备，利用测定试剂(先前所描述的；ΙΟΟμΜPB1-3939)分析裂解物，并如先前所描述的侧量发光(图31)。数据证明OgLuc变体的较小的片段也可产生发光。 [0523] 实施例25——OgLuc变体的密码子优化 [0524] A.1V 和 9B8 [0525] IV和9B80gLuc变体用作密码子优化的模板。如本领域中的那些技术人员所理解的，目的是双面的:1)去除可能能够干扰OgLuc变体的调控或表达的已知的转录因子结合位点或其他调控序列，例如，启动子组件，剪接供体/受体位点，剪接沉默子，Kozak序列和聚腺苷酸信号，和2)改变DNA序列(经由不改变蛋白序列的沉默突变)以消除罕用的密码子，并偏好大肠杆菌、人类、其他哺乳动物或其他真核生物体的细胞中的最常用的密码子(Wada 等.，Nucleic Acids Res.，18:2367 (1990))。 [0526] 对于每个变体设计了称作opt (又称optA)和optB的两个不同的IV和9B8的优化的序列。通过对每个位点鉴定两种最佳的，即最常见的人类密码子(参见表17)且然后随机地选择二者之一以在每个位点掺入来对每个变体设计了优化的序列，即opt/optA。对于optB形式，先前的，密码子使用的优化的形式，S卩，opt/optA，用作起始模板，且每个密码子被关于该密码子优化策略所鉴定的两个最佳人类密码子中的另一个所替换。作为例子，IV序列或9B8序列中的第3位的亮氨酸由密码子TTG所编码。TTG不是人类细胞中的亮氨酸的两种最常见密码子之一，且因此将该密码子变为替代的，亮氨酸更常用的密码子，CTC(opt/optA)或CTG(optB)。对于该序列中的所有亮氨酸重复此相同的过程，且由于方法的随机性质，CTC密码子可终止于optB和CTG可终止于optA。由于该两密码子使用方法的优化，序列opt/optA和opt B最大的密码子不同的。 [0527] 表17:密码子优化中所用的密码子 [0528] [0529] [0530] 如上所述分析4个序列(IV opt, IV optB ;9B8opt, 9B8optB)中的每一个的转录因子结合位点或其他调控序列的存在(Genomatix Software, Germany),并通过沉默核苷酸改变破坏这些不需要的序列。在一些情况下，其中存在人类和大肠杆菌的其他非罕见密码子时，通过改变为这些密码子之一来去除转录因子结合位点或其他调控元件，即使它们不是选择#1或选择#2(参见表18)。在这些情况中,其中去除转录因子结合位点或其他调控元件将涉及导入罕见的密码子，通常不改变转录结合位点(或其他调控元件)。 [0531] 表18:用于去除转录因子结合位点和其他调控元件的另外的密码子 [0532] [0533]通过本领域已知的方法生成了 IV ( “IV opt” (SEQ ID NO:22)和 “IV optB” (SEQID NO:23))和 9B8( “9B8opt” (SEQ ID NO:24)和 “9B8optB” (SEQ ID NO:25))的密码子优化的形式并将其克隆到pF4Ag中。将HEK293细胞以15，000个细胞/孔接种在96孔平板中并在37°C下过夜生长。第二天，利用IOOng的在pF4Ag中编码密码子优化的形式的质粒 DNA,利用 TRANSiT 丨:;.--LTlTransfection Reagent (Mirus Bio)将细胞瞬时转染到 6孔重复中并在37°C下培养过夜。还利用pGL4.13(Luc2/SV40) (Paguio等，“pGL4Vectors:ANew Generation of Luciferase Reporter Vectors Promega Notes, 89:7-10(2005))或pGL4.73 (hRL/SV40)(同前)转染了 HEK293细胞以对于转染效率的差异进行标准化。使用了 IOng/转染或10%的总DNA转染。去除培养基，并利用100 μ L裂解缓冲液裂解细胞以生成裂解样品，所述裂解缓冲液含有IOmM CDTA，150mM KCl, IOmM DTT, IOOmMHEPES,pH7.0,35mM 硫脲，和 0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v)。如下在 TECAN® INFINITE® F500 光度计上测量裂解物样品的发光:对于hRL和OgLuc变体，利用含20 μ M底物的50 μ L裂解缓冲液测定10 μ L裂解样品的发光(对于hRL为天然腔肠素和对于OgLuc变体为ΡΒΙ-3939)。对于 Luc2 (SEQ ID NO: 28 和 29)，萤火虫荧光素酶，利用 50 μ L 的 BRIGHT-GL0™Luc if erase测定试剂(Promega Corp.)测定10 μ L裂解样品的发光。 [0534] 图32显示了对于含OgLuc变体的密码子优化的形式的裂解物测量的发光与hRL和Luc2的比较。利用本领域在已知的方法将hRL和OgLuc变体关于pGL4.13标准化并将Luc2关于pGL4.73标准化。如图32中所示，Luc2具有比hRL高约14倍的发光。OgLuc变体与Luc2和hRL相比较具有较高的发光。IV( “IV opt”和“IV optB”)和9B8 ( “9B8opt”)的密码子优化的形式显示了与非优化的形式相比较增高的发光。 [0535] 作为优化的结果，“opt/optA”形式在人类HEK293细胞中比其亲代序列表达的更好，而“optB”形式在HEK293细胞中与亲代序列相比较未有同样表达。 [0536] B.L27V [0537] 优化L27V变体(SEQ ID NO:88)以将常见脊椎动物应答元件(Genomatix数据库中的任何转录因子结合位点(TFBS))的发生最小化。构建了 L27V变体的三种不同的优化的形式: [0538] 1.L27V01-形式1(SEQ ID NO: 319)-除单独的TFBS夕卜，通过核苷酸置换去除了启动子组件和全部其他的不需要的序列元件(其他细节见下文)。 [0539] 2.L27V02-形式2-L27V01用作起始序列，即，亲代序列，并利用高严格度匹配标准尽可能第去除TFBS(较高的严格度涉及与结合位点的更好的匹配并将因此比较低严格度发现更少的匹配)。构建 了 L27V02的两种形式，A(SEQ ID NO:322)&B((SEQ ID N0:318))。这两种形式通过对每种形式选择不同的密码子以去除不需要的序列元件来构建。通过利用较低严格度关于TFBS进行搜索来分析两种形式。 [0540] 3.L27V03-形式 3(SEQ ID NO:325)-L27V02B(SEQ ID N0:318)用作起始序列。在可能时去除较低严格度的TFBS匹配。构建L27V03为与L27V02A非常不同的密码子。 [0541 ] 使用了以下标准来构建L27V优化的变体: [0542] 1.密码子使用:优选地，对每种氨基酸使用最佳的两种人类密码子(如关于IV变体所做的)，并避免罕见的人类密码子(HS ;编码〈10%的氨基酸)的使用(表19)。若需要，使用罕见的大肠杆菌密码子(EC)以去除不需要的序列元件。 [0543] 表 19 [0544] [0546] 2.在可能时去除不需要的序列元件 [0547] A.限制酶(RE)位点:去除可能对克隆有用的RE位点且或者应该不出现在开放读码框(ORF)中。 [0548] B.真核序列元件:去除(+)mRNA链中的剪接供体和受体位点，剪接沉默子，Kozak序列和聚腺苷酸序列。 [0549] C.去除脊椎动物启动子组件(PM)(在Genomatix目录中:脊椎动物)。 [0550] D.在可能时去除脊椎动物TFBS (在Genomatix目录中:脊椎动物，通用核心启动子元件和各种其他序列)。这仅应用于L27V优化形式2和3，并不应用于形式I。 [0551] E.大肠杆菌序列元件:去除了大肠杆菌启动子。 [0552] F.mRNA二级结构:去除近5’端的强二级结构(高mRNA折叠能量)(Zuker,NucleicAcid Res.31 (13): 3406-3415 (2003))和其他强发夹结构。 [0553] 表20提供了序列比对，成对序列同一性百分比(“ O ”表示核苷酸差异的数目)。 [0554]表 20 [0555] [0556] 实施例26-OgLuc变体的信号稳定性 [0557] A.15C1，9B 和 IV [0558] 利用PB 1-3945测量了 15C1的信号稳定性和利用PB 1-3889测量的9B8的信号稳定性并与IV相比较。培养含编码15C1、9B8或IV的质粒DNA的大肠杆菌，并如先前所描述的在8孔复制中诱导。利用含300mM HEPES pH8.0，0.3X被动裂解缓冲液(“PLB” ；Promega Corp.目录号E194A) 0.3mg/mL溶菌酶和0.003U/μ L RQlDNA酶的裂解缓冲液裂解细胞。将裂解物以1:1000稀释于裂解缓冲液中并利用TECAN® INFmiTE® F500光度计测量发光。在向10 μ L的稀释的裂解物样品中添加含150mM KCl, ImM CDTA，IOmM DTT,IOOmM 硫脲，0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v)的 50 μ L 的 “Glo” 0.5%TERGIT0L 测定缓冲液(“0.5%TERGIT0L”)和20 μ M的新型腔肠素ΡΒΙ-3945或ΡΒΙ3889后立即进行测量。 [0559] 通过在将测定缓冲液添加到样品后一段时间中每30秒重新读取平板来确定变体的信号稳定性。利用本领域中已知的方法从这些测量结果中确定信号半衰期。在变体和IV之间比较平均信号半衰期。15C1和9Β8具有至少30分钟的信号半衰期(图33)。虽然利用ΡΒΙ-3945测定的15C1在t=0时具有较高的发光，但信号衰减得比利用PB1-3889测定的9B8变体更快。在t=10分钟时，利用PB1-3945的15C1的发光和利用PB1-3889的9B8的发光时相同的。 [0560] B.9B8opt+K33N [0561] 检查了 9B8opt+K33N变体的信号稳定性。制备了含变体的大肠杆菌裂解物并如先前所描述的进行分析，不同的是测定缓冲液含U.25% TERGHOL® NP-9 (v/v), IOOmMMES pH6.0, ImM CDTA，150mM KC1，35mM 硫脲，2mM DTT，和 20μΜ PB1-3939。表 22 显示了变体的以分钟计的信号半衰期，且表明氨基酸置换L27V提高了信号稳定性。 [0562] 表22 =OgLuc变体在细菌裂解物中的信号稳定性 [0563] 样品 信号半衰期(分钟)(min) [0564] [0565]测量 L27V 变体(9B8+K33N+L27V+T39T+K43R+Y68D ;SEQ ID NO:88 和 89)的信号活性和稳定性并与萤火虫荧光素酶和海肾属荧光素酶的相比较。将L27V变体、Luc2荧光素酶和海肾属荧光素酶与HALOTAG®融合并在大肠杆菌中表达。利用HALOTAG®作为纯化标签根据制造商的方案纯化荧光素酶(pFNlSA ; HALOTAG®Protein Purification System)。将IOpM的每种纯化的突光素酶(在无酹红的含0.01% PRiONEX-)的DMEM中稀释)与等体积的测定试剂(对于L27V变体为IOOmMMES pH6, 35mM 硫脲，0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v), ImM CDTA, 2mM DTT，150mM KCl，和100 μ ΜΡΒΙ-3939 ;对于萤火虫荧光素酶为 ONE-GLOtmLuc if erase Assay System (PromegaCorp.);和对于海肾属突光素酶为 RENILLA_GL0TMLucif erase Assay System (PromegaCorp.))相混合，并随时间推移(3、10、20、30、45和60分钟)监测发光。图34A-B表明了当与萤火虫荧光素酶和海肾属荧光素酶相比较时L27V变体的高比活性(图34A)和信号稳定性(图34B)。 [0566] 实施例27——OgLuc变体的酶动力学 [0567] A.1V，15C1，9B8，9F6 和 9A3 [0568] 利用本领域中已知的方法，利用含IV和IV变体15C1、9B8、9F6和9A3的大肠杆菌的裂解物进行测量发光的酶动力学测定。如实施例26中所描述的诱导、裂解和稀释细胞，不同的是裂解缓冲液PH为7.5。如先前在实施例26中所描述的利用稀释的裂解物测定测定缓冲液中的两倍连续稀释的PB1-3939。图35显示了利用IV和变体15C1，9B8，9F6和9A3的双曲线拟合计算的Km和Vmax值。变体9B8和9F6与IV相比较具有较高的Km，而其他变体的Km不变。与IV相比较，变体15C1，9B8和9F6均具有较高的Vmax值，而8A3具有较低的Vmax值。 [0569] 15C1，其利用PB1-3945具有最高的发光，含氨基酸置换K33N，表明K33N提供了增高的发光。生成了 9B8变体以使该另外置换为该变体提供发光的增加。生成了 9B8和9F6的另外的变体以具有氨基酸置换K33N或V38I中的至少一种(“9B8+K33N+V38I”和“9F6+K33N”)。变体1D6用于加强第68、72和75位的氨基酸置换对于增加光输出和稳定性的重要性。图36显示了利用关于IV和变体9B8、9B8+K33N+V381、9F6、9F6+K33N和1D6的双曲线拟合计算的Km和Vmax值。虽然关于9B8和9F6的图35和36之间的实际Km值是不同的，但变体之间的一般趋势是一致的。 [0570] 确定了酶动力学，即Vmax和Km值并如前所述对于变体9B8opt和9B8opt+K33N进行比较，不同的是利用含 ImM CTDA, 150mMKCl,2mM DTT, IOOmM MES pH6.0，35mM 硫脲，0.25% TERGiTOLiiv NP-9 (v/v)，10mg/mL2-羟丙基-β -环糊精和 20 μ ΜΡΒΙ-3939 的缓冲液测 定大肠杆菌裂解物。在TECAN® INFINITE® F500光度计上测量发光。如图37中所示，9B8opt+K33N的Vmax和Km值高于9B8opt，表明该克隆较亮并具对底物具有较低的亲和力。 [0571 ] B.9B80PT+K33N 变体 [0572] 如先前所描述的确定OgLuc变体的酶动力学值，不同的是利用GLOMAX®光度计测量发光。对于每个变体使用三个重复。表23显示了利用HYPER.EXE，版本1.0计算的具有标准偏差的平均Km和Vmax (分别为“Km(+/-) ”和“Vmax (+/-) ”。 [0573]表 23:OgLuc 变体的 Vmax 值(RLU/0.5 秒)和 Km ( μ M)值 [0574] [0575] 实施例28——OgLuc变体的蛋白稳定性 [0576] 由于荧光素酶蛋白的稳定性是影响发光另一因素，确定了蛋白稳定性，S卩，热稳定性。 [0577] A.15C1，9B8，9F6，8A3 和 IV [0578] 如先前所描述的从诱导的培养中制备了含15C1，9B8，9F6，8A3或IV的大肠杆菌和表达hRL(SEQ ID N0:30和31)的大肠杆菌的裂解物。用包含含0.1%明胶的IOmM HEPESPH7.5的缓冲液1:1000稀释裂解物样品。在50°C下孵育两个重复的96孔平板中的稀释的裂解物(IOOyL)样品。在不同的时间点，将平板置于_70°C (零下七十摄氏度)。如先前所描述的测量发光之前，在室温即22°C下融化每个平板10分钟。利用天然腔肠素作为底物测定样品(10 μ L的每个融合的样品)。对于每个时间点平板在添加测定缓冲液之后立即测量发光。利用本领域中已知的方法对每个时间点从发光数据中计算指示蛋白稳定性的蛋白的半衰期。 [0579] 表24显示了分别具有以分钟(小时)计的为630.1 (10.5)，346.6 (5.8)，770.2(12.8)和65.4(1.1)的变体15C1、9B8、9F6和8Α3的蛋白稳定性。相比较地，hRL具有9.6分钟的半衰期，而IV具有27.2分钟的半衰期。表24还显示了在4小时时，15CL9B8,和9F6的分别为79%，61%，和80%，保持活性。 [0580] 表24:50°C时OgLuc变体的蛋白稳定性 [0581] [0582] B.1D6，9B8，9B8+K33N+V38I，9F6，9F6+K33N，和 IV [0583] 从诱导的培养制备含1D6，9B8，9B8+K33N+V38I，9F6，9F6+K33N或IV的大肠杆菌的裂解物，并如先前所描述的测定发光。在该实施例中如上所述测定蛋白稳定性，即，裂解物的热稳定性。图38显示了变体在50°C下以分钟计的半衰期，和利用天然腔肠素作为底物在孵育期间的起始即t=0测量的样品的发光。变体9B8+33+38和9F6之间的差异为一个氨基酸置换，L27V，表明该氨基酸置换增高了稳定性。第68、72和75位的“活性/表达”置换的增加提高了稳定性。图38显示了所提供的K33N为变体9F6提供了更高的热稳定性且变体9B8比变体1D6具有更高的光输出和稳定性。该两种变体之间的差异，即，9B8含另外的氨基酸置换F68Y，L72Q，和M75K，表明了该三种置换的重要性。 [0584] 除热稳定性外，由表达决定的结构完整性、稳定性和溶解度也可影响发光。作为进一步试验改良的变体的结构完整性的方式，将含基于pF4Ag(即，无HT7)的OgLuc变体N166R(先前描述于美国申请序列第12/773，002号(美国公开申请第2010/0281552号))、C1+A4E、IV、9B8和9F6的KRX大肠杆菌在37°C下培养于Luria肉汤(LB)至0D_=0.6且然后通过添加鼠李糖(0.2%终浓度)诱导过表达。然后在25°C或37°C下培养重复诱导的培养17小时，在该时间制备总(T)级分和溶解(S)级分并通过SDS-PAGE利用SMPLYBLUE™SafeStain (Invitrogen)以染色凝胶而进行分析(图39A-B)。hRL和Luc2用作对照。 [0585] 当诱导发生在25°C下时，OgLuc变体、hRL和Luc2良好表达且为可溶的(图39A ;注意对于OgLuc变体“可溶”级分中的约19kDa黑色条带，除去NI66R变体，对于hRL和Luc2 “可溶”级分中分别约36kDa条带和64kDa条带)。相比之下，虽然C1+A4E，IV，9B8和9F6在37°C下表达良好(如“总”级分中所示的，显著优于hRL或Luc2)，当使用增高的诱导温度时，仅9B8和9F6变体是可溶的(参见图39B ;注意对于9B8和9F6在“可溶”部分中约19kDa黑色条带)。这些结果与表24和图38中所示的热稳定性数据一致。 [0586] C.9B80PT 和 9B80PT+K33N [0587] 比较了变体变体9B8opt和9B8opt+K33N的热稳定性。制备了含变体9B8opt或9B8opt+K33N的大肠杆菌裂解物并除以下不同外如先前所描述的进行分析:在先前描述的裂解缓冲液中1:100稀释裂解物并在温度循环器中在60°C下孵育重复稀释的裂解物。在不同的时间点移去等份并置于干冰上以冷冻样品。在22°C下融化冷冻的裂解物并利用含 20mM CDTA, 150mM KCl, IOmM DTT, 20 μ MPB1-3939, IOOmM HEPES ρΗ7.0，35mM 硫脲，和 0.1% TERGITOL® NP-9 (v/v)的缓冲液进行测定。在 GLOMAX® 光度计(PromegaCorp.)上测量发光。图40A显示了随时间推移(以分钟计)以RLU为单位测量的发光的自然对数值的光输出时间过程。如图40B中所示的，9B8opt+K33N在60°C下具有6.8小时的半衰期，其比9B8opt的5.7小时的半衰期要长。 [0588]表 25 显示了 9B8opt 和 9B8opt+K33N 在 60°C下的热稳定性(“T172 (60V )，，)，和在孵育时间的起始(即，t=0)时的发光(“RLU”)数据。9B8opt+K33N更稳定且亮度比9B8opt高约1.8倍，表明氨基酸置换K33N提供了更高的光输出和更高的热稳定性。 [0589] 表25:9B8opt和9B8opt+K33N的热稳定性和发光数据 [0590] [0591] D.9B8+K33N 变体 [0592] 如前所述检查60°C下的变体的热稳定性，不同的是测定缓冲液含IOOmM MESPH6.0而非HEPES。表26和图41显示了在60°C下变体的以小时计的半衰期。数据表明氨基酸置换L27V提高了热稳定性。 [0593] 表26 =OgLuc变体在60°C下的热稳定性 [0594] [0595]还在 HEK293 细胞中筛选了变体 9B8 和 V2 (9B8+K33N+T39T+K43R+Y68D)以确定其稳定性。如先前所描述的将变体克隆到pF4Ag中并转染到HEK293细胞中(15，000个细胞/孔)。转染后，在测定试剂中裂解细胞(如先前所描述的；无？81-3939)，利用含20-皿PB1-3939的测定试剂测量发光。9B8具有5.2小时的半衰期，而V2具有16.8小时的半衰期。这与在大肠杆菌中关于这些变体所发现的半衰期一致(表26)。 [0596] E.L27V 变体 [0597] 在不同的pH下和不同的盐条件下评价L27V变体(9B8+K33N+L27V+T39T+K43R+Y68D)的活性。先前已显示 9B8 和 9B8+K33N 在 pH6 和 pH7 下具有相似的稳定性(数据未示出)。为评价不同的盐条件下的活性，将含20μΜ PB1-3939的50 μ L的测定缓冲液和不同的量的KCl或NaCl与利用L27V(pF4Ag)瞬时转染的50 μ L的ΗΕΚ293细胞相混合。测量发光，确定活性百分比(发光与不含盐的比率)(图42Β)。为评价不同的pH中的活性，制备了含IOOmM柠檬酸盐，IOOmM MES, IOOmM PIPES, IOOmM HEPES,IOOmMTAPS, 0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v)，0.05% MAZU® DF204, ImMCDTA，和 ImM DTT的试剂，针对不同的pH值滴定。将测定试剂中的362pM 1-27¥与底物10(-11 PB1-3939相混合并测量发光(图42A)。 [0598] 实施例29-OgLuc变体的凝胶过滤色谱分析 [0599] A.C1+A4E 和 9B8 [0600] 使用凝胶过滤分析基于理论值来验证纯化的OgLuc蛋白的期望的分子量，并从而确定其低聚状态。通过凝胶过滤色谱进行OgLuc变体C1+A4E和9B8的相对流体动力学体积之间的比较。为进行该分析，将OgLuc变体C1+A4E和9B8的核苷酸序列克隆到HQ-TaggedF1EXI® Vector (Promega Corp.)中以构建在大肠杆菌KRX细胞中过表达的HQHQHQ N-末端标记的蛋白。利用 HISLINK™Protein Purification System (Promega Corp.)根据制造商的说明纯化过表达的蛋白。通过凝胶过滤色谱分析每个单独的标准和样品蛋白的样品，在24°C下在Agilentl200HPLC上进行，利用流速为0.25mL/分钟的Superdex2005/150GL柱(GE Healthcare)。流动相(即，电泳缓冲液)由 5OmM Tris 和 I5OmM NaCl, pH7.5 组成。在214和280nm处监测蛋白洗脱。利用以下生成了标准校准曲线:1)卵清蛋白，43kDa(GEHealthcare), 2)碳酸酐酶,29kDa (Sigma)和 3)肌红蛋白，17kDa (Horse Heart, Sigma)。直接从校准曲线计算纯化的蛋白的分子量。 [0601] 在7.98分钟时利用该柱观察的蛋白的相对洗脱为卵清蛋白，在8.65分钟时为碳酸酐酶，在8.97分钟时为9B8，和在9.06分钟时为肌红蛋白(图43A-B)。如图43B中所示，9B8洗脱为21kDa蛋白(预测的分子量为约19kDa)，表明9B8作为单体而存在，而C1+A4E在约4.3分钟时洗脱(图43A)，表明C1+A4E被表达并作为多聚体而存在，例如，可能作为四聚体复合物或更大的复合物。 [0602] B.L27V 变体 [0603] 为证明OgLuc变体L27V以单体状态存在，利用凝胶过滤分析基于理论值来验证纯化的L27V蛋白的期望的分子量，并从而确定其低聚状态。通过凝胶过滤色谱进行L27V的相 对流体动力学体积。为进行该分析，将L27V变体的核苷酸序列克隆到HaloTag® VectorpFN18A(Promega Corp.)中以构建在大肠杆菌KRX细胞中过表达的HaloTag®-末端标 记的蛋白。利用 HaloTag® Protein PurificationSystem (Promega Corp.)根据制造商 的说明纯化过表达的蛋白。通过凝胶过滤色谱分析每个单独的标准`和样品蛋白的样品，在 24°C下在 Agilentl200HPLC 上进行，利用流速为 0.25mL/ 分钟的 Superdex2005/150GL柱(GE Healthcare)(图 56)。流动相(即，电泳缓冲液)由 50mMTris 和 150mM NaCl，PH7.5组成。在214和280nm处监测蛋白洗脱。利用以下生成了标准校准曲线:1)卵清蛋白，43kDa(GEHealthcare), 2)肌红蛋白，17kDa(Horse Heart, Sigma)和 3)核糖核酸酶，14kDa (Bovine pancreas, GE Healthcare)。如图 44 中所不，L27V 变体洗脱为 24kDa 蛋白(预测分子量为约19kDa)，表明其作为单体而存在。 [0604] 实施例30——OgLuc变体的蛋白表达水平 [0605] A.1V,8A3，8F2，9B8，9F6 和 15C1 [0606] 蛋白表达的标准化提供了关于比活性的可能差异的信息。为提供量化蛋白表达的方式，如先前所描述的将OgLuc变体克隆到含C-末端HT7的pF4Ag载体中以生成OgLuc变体-HT7融合蛋白。生成了以下的融合蛋白:IV-HT7(SEQ ID NO: 48和49)，8A3-HT7 (SEQ IDN0:34和35)，8F2-HT7(SEQ ID NO: 50 和 51)，9B8-HT7 (SEQ ID NO: 36 和 37)，9F6-HT7 (SEQID N0:38 和 39)，和 15C1-HT7(SEQ ID NO:52 和 53)。使含 OgLuc 变体-HT7 融合体的大肠杆菌生长并如先前所描述的进行诱导。用IOOyL的10X FASTBREAK™Cell裂解试剂(Promega Corp.)裂解 900 μ L 的细胞培养物。将 HALOTAG® TMR-配体(PromegaCorp.)添加到每个细菌裂解物样品以获得0.5μΜ的终浓度。在室温下根据制造商的说明利用H ALOTA(1.¾: TMR-配体孵育细菌裂解物30分钟。利用IX FASTBREAK™稀释10 μ L的每种样品，即，将10 μ L样品添加到10 μ LlX FASTBREAK™。对于每种样品通过SDSPAGE分析15 μ L的裂解物和15 μ L的1:1稀释液。通过SDS-PAGE解析标记的融合蛋白，用 SIMPLYBLUE™SafeStain(图 45A)和荧光成像仪(GE Healthcare Typhoon)染色。利用 Imagequant 软件(GE Healthcare)定量条带。图 45B 显不了从关于 IV-HT7 ( “IV”),15C1-HT7( “15C1”)，9B8-HT7( “9B8”)，9F6-HT7 ( “9F6”)，和 8F2-HT7 ( “8F2”)的图 45A测量的条带体积，关于IV-HT7标准化。数据显示了与IV相比较IV变体良好表达。 [0607] B.9B8opt, V2 和 L27V [0608] 比较了 9B8opt，V2和L27V的表达水平和溶解度。在pF4Ag背景环境中，使用该三种变体来转化大肠杆菌KRX细胞。所得的克隆用于表达实验，其中在30°C下生长过夜以1:100稀释于LB中的单独的克隆，生长至0D_约0.5，且然后在25°C下用0.2%鼠李糖诱导18小时。然后在0.5X FASTBREAK™裂解试剂(Promega Corp.)存在下在室温下孵育细胞30分钟，并将所得裂解物贮存在-20°C下。在冰上缓慢融化后，通过在4°C下高速离心10分钟来制备可溶的级分。然后利用SDS-PAGE+简易蓝 染色(图46A)以及通过测量发光分析粗的总(T)级分和可溶(S)级分的表达。为进行发光测量，将96孔微滴板中的50 μ L可溶的裂解物与50 μ L测定试剂(先前所描述的；40 μ L PB1-3939)相混合，并利用TECAN® INFINITE® F500多检测平板阅读器测量发光。这些结果表明该三种变体关于其表达水平和溶解度的排序为L27V>V2>9B8opt。 [0609] 实施例31——在哺乳动物细胞中表达的OgLuc变体的亮度 [0610] A.1V 和 9B8 [0611] 在HEK293细胞中评估pF4Ag载体(即，无HT7)中的IV和9B8变体的亮度。hRL用作对照。简言之，将以15，000个细胞/孔接种在96孔平板中的HEK293细胞利用含编码不同的变体序列和/或对照序列的质粒DNA的TRANSIT⑧-LTl进行瞬时转染。如实施例25中所描述的培养细胞，进行裂解和处理。利用pGL4.13 (Promega Corp.)作为转染对照共转染细胞(使用IOng/转染或转染的总DNA的10%)。利用天然腔肠素作为hRL的底物或利用PB1-3939作为OgLuc变体的底物如先前所描述的测量发光。关于转染效率利用Luc2发光(即，在添加荧光素底物后测量发光)校正OgLuc变体数据。与hRL相比较OgLuc变体IV和9B8具有更高的发光(图47)。 [0612] 为在哺乳动物细胞中在每摩尔基础上进行亮度的比较，对实施例30中所描述的变体9B8的HT7融合蛋白(“pF4Ag-0gLuc-9B8-HT7”)进行分析并与C-末端HT7_hRL融合蛋白(“pF4Ag-海肾属-HT7”)和C-末端HT7-Luc2融合蛋白(“pF4Ag-Luc2-HT7”)相比较。接种HEK293细胞(15,000)并在37°C下生长过夜。利用来自pF4Ag-Renilla_HT7，pF4Ag-Luc2-HT7 或 pF4Ag-0gLuc-9B8-HT7 的 IOOng 的 DNA 转染这些细胞并在 37°C下生长过夜。去除培养基并如先前所描述的裂解细胞。对10 μ L的每种样品测定发光(RLU)，利用对于Luc2的50 μ LBRIGHT-GL0™Luc2，对于hRL的50 μ L的20 μ M天然腔肠素，和对于变体9Β8 的 50 μ L 的 20 μ M ΡΒΙ-3939。 [0613] 混合来自6孔的裂解物并如实施例30中所描述的用HALOTAG® TMR-配体进行标记。通过SDS-PAGE解析标记的融合蛋白并进行突光成像(GE Healthcare Typhoon)。确定条带密度以定量关于每种荧光素酶存在的相对摩尔数，并通过计算条带浓度来标准化每种蛋白的表达水平而标准化关于每种样品的RLU值，S卩，利用TMR标记定量来标准化RLU(图48)。在摩尔比摩尔基础上，9B8变体比Luc2亮度高约15倍，且比hRL高约100倍。该数据代表了比活性的差异。 [0614] B.9B8opt 和 9B8opt+K33N [0615] 测量在HEK293细胞中表达的变体9B8opt和9B8opt+K33N的亮度，并如实施例31中关于不含HT7的变体所描述的进行比较。使用含变体DNA的30和IOOng的质粒DNA来转染HEK293细胞。生长细胞并如实施例31中所描述的进行诱导，不同的是利用含ImMCTDA，150mM KCl,2mM DTT, IOOmM MES ρΗ6.0，35mM 硫脲，0.25% TERGITOL* NP-9 (v/v)，和10mg/mL2-羟丙基-β -环糊精的裂解缓冲液裂解细胞。用含20 μ M PB1-3939的裂解缓冲液测定裂解物并在TECAN® GEN10S™Pro光度计上测量发光。如图49中所示,在HEK293细胞中与9B8相比较9B8opt+K33N具有更高的发光，这与表25和图29中的细菌表达数据相一致。 [0616] C.9B8+K33N 变体 [0617] 如先前所描述的测量HEK293细胞和NIH3T3细胞中表达的变体的亮度。将变体的发光关于9B8opt产生的发光标准化(表27)。 [0618] 表27:NIH3T3细胞和HEK293细胞中由OgLuc组合变体产生的发光的增加 [0619] [0621] 进行L27V变体与单独的萤火虫荧光素酶和作为融合体的萤火虫荧光素酶的发光的比较。分别以15，000和10，000个细胞/孔将HEK293细胞和HeLa细胞接种到12孔平板的孔中并在37°C、5%C02下过夜孵育。然后利用连续稀释的含L27V或Luc2的pF4Ag转染细胞。2Ong 的 pGL4.13 (Promega Corp.)与 L27V 共转染，和 2Ong 的 pGL4.73 (Promega Corp.) 与Luc2共转染以用作用于L27V或Luc2质粒DNA的载体DNA。然后利用TRANSlTd LTI 转染试剂根据制造商的说明将质粒DNA转染到细胞(对于每种细胞类型每个稀释6个重复)中。然后在37°C下，5%C02下孵育细胞24小时。 [0622] 转染后，从细胞去除培养基，并添加含0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v)的100 μ LPBS 并在室温下振荡 10 分钟。利用 0NE-GL0™Luciferase Assay System (Promega Corp.；Luc2)或测定试剂(实施例22!1含2( 1 PB1-3939 ;0gLuc)。如先前所描述的关于HEK293细胞(图50A)和HeLa细胞(图50B)测量发光。 [0623] 如上所述进行作为融合伴侣的L27V和Luc2的比较。将L27V和Luc2与pF4Ag中的HALOTAG®蛋白融合。图50C-D显示了在HEK293细胞(图50C)和HeLa细胞(图50D)中利用不同的融合体测量的发光。 [0624] 除测量发光外，还分析了蛋白表达。如上所述进行转染。转染后，从细胞去除培养基，并在IX PBS中洗涤细胞。添加含I μ M HALOTAG®' TMR配体(Promega Corp.)和20U DNA酶I的100 μ L0.1X哺乳动物裂解缓冲液(Promega Corp.)，并在室温下在缓慢振荡下孵育细胞45分钟。然后在_20°C下冷冻细胞样品。对于蛋白分析，将32.5μ L4X SDS上样染料添加到每种样品，并将样品在95°C下加热2分钟。然后将10 μ L样品上样到SDS-PAGE凝胶上，并如先前所描述的在Typhoon Scanner上成像(图50E)。 [0625] 实施例32——与萤火虫荧光素酶相比较纯化的OgLuc变体的亮度 [0626] 如在实施例33中所描述的过表达并纯化9B80gLuc变体。利用以下的2X缓冲液/测定试剂在稀释的酶和底物之间进行反应:100mM MES pH6.0, ImM CDTA，150mM KCl,35mM硫脲，2mMDTT,0.25% TERGITOL® NP-9 (v/v)，0.025% MAZU® DF204，10mg/mL2_ 羟基-β -环糊精，和20 μ M PB1-3939。纯化的酶和底物的最终测定浓度分别为0.5pM和10 μ Mo并行地，分析稀释的纯化的萤火虫荧光素酶(即，QUANTILUM® RecombinantLuciferase (Promega Corp.))和突光素之间的反应。萤火虫突光素酶反应的测定缓冲液/试剂是BRIGHT-GL0™，和最终测定浓度为0.5pM酶和500 μ M荧光素。由于对于每个反应已知缓冲液/试剂提供“辉光”动力学，使用15分钟时间点来采集发光数据。来自该实验的结果显示利用 PB1-3939(19, 200RLU)的 9B8opt 亮度比利用 BRIGHT-GL0™(2, 300RLU)的 QUANTiLUM® Recombinant Luciferase 高约 8 倍。 [0627] 实施例33——抑制分析 [0628] 为确定OgLuc变体对于脱靶相互作用的敏感性，针对LOPAC (药理活性化合物的文库)文库筛选9B8和L27V变体的活性。通过将化合物在DMSO中稀释至ImM而制备L0PAC1280文库(Sigma)。在测定当天，将化合物在IX PBS中稀释至20 μ M，并将10 μ L转移到96孔白色平板。向每孔添加在Glo Lysis Buffer (Promega Corp.)中以10-4稀释的1 的纯化的988，L27V或萤火虫荧光素酶(Lu2)并在室温下孵育2分钟。向样品中添加 20 μ L 测定试剂(ImM CDTA, 150mM KCl, 2mM DTT, IOOmM MES ρΗ6.0，35mM 硫脲，0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v)和 60 μ M PB1-3939)，孵育 3 分钟，并在 TECAN®GEN10S™Pix)光度计上测量发光。为测定萤火虫荧光素酶，根据制造商的方案使用BRIGHT-GL0™测定试剂(Promega Corp.)。作为阴性对照，每个平板的8个孔含IX PBS+2%甘油。作为阳性对照，每个平板的8个孔含含于2%DMS0中的2mM苏拉明或含于2%DMS0中的2mM荧光素酶抑制剂I (Calbiochem)。在LOPAC文库的初级筛选中(即，利用用20μΜ的较低底物浓度的9Β8变体筛选LOPAC文库)鉴定了苏拉明为OgLuc的抑制剂。 [0629] 图51中的结果表明LOPAC文库和L27V中的化合物之间的脱靶相互作用的一般低频率。这表明L27V作为用于包括基于活细胞的形式的不同的化学品和治疗候选物的大型文库(例如，高通量筛选)的筛选工具的潜在用途。 [0630] 为进一步检查抑制性，针对不同浓度的苏拉明(Sigma S-2671)和TyrphostinAG835(“Tyr ag835”) (Sigma T-5568)筛选纯化的 9Β8 和 L27V(图 52A-C)。图 52E-D 分别显示了 Suramin和Tyr ag835的化学结构。如上所述制备纯化的9B8和L27V。在含2%DMS0的 IX 卩85中制备抑制剂的连续稀释(0，2“]\1，64]\1，2( ]\1，6( ]\1，20( ]\1和21111)。向 96孔白色测定平板的孔中添加10 μ L的稀释的酶和10 μ L的稀释的抑制剂并在室温下孵育2分钟。添加20 μ L测定试剂(如上所述)，并在(iLOM/\X::.R:-96光度计上测量发光(图52A-C)。图52A-B显示了 9B8和L27V对于苏拉明(图52A)和Tyr ag835 (图52B)的剂量应答曲线。图52C显示了对于9B8和L27V苏拉明和Tyr ag835的半数最大抑制浓度(IC5tl)。数据表明L27V是可用作不同的化学制品和/或治疗候选物的大型文库的筛选工具的稳固的报告者。 [0631] 实施例34——对非特异性蛋白相互作用的抗性 [0632] 1.将纯化的9B8和L27V酶在含或不含0.5mg/mL BSA的缓冲液(IX PBS, ImM DTT和0.005% IGEPAL® CA-630)中以1:10稀释至200μ L到PCR管中。在60°C下孵育样品，其中在0，2，4和6小时时将每个变体的一组稀释液转移到_70°C。 [0633] 为分析活性，在水浴中将样品融化至室温。添加50 μ L的测定试剂(如先前所描述的含100 μ M PB1-3939)，并在TECAN_ INFINITE# F500平板阅读器上对于每分钟测量发光持续30分钟。利用IxlO6和IxlO7稀释的平均发光计算活性(图53)。 [0634] 2.为证明OgLuc变体对塑料的反应性，将纯化的9B8和L27V与聚苯乙烯平板接触，并测量其活性。 [0635] 在60、40、20和O分钟时，将不含酚红含0.1% PRIONEX®的DMEM中的50 μ L纯化的9Β8(45.3ρΜ)和L27V(85.9pM)置于96孔聚苯乙烯微滴板的孔中。向样品中添加含20 μ M PB1-3939的50 μ L测定试剂(如上所述)并在室温下孵育5分钟。如先前所描述的测量发光，并确定活性百分比(图54 ;发光与时间O的 比率)。 [0636] 实施例35——翻译后修饰 [0637] 为确定当在哺乳动物细胞中表达时，OgLuc变体是否经历任何翻译后修饰，在哺乳动物细胞和大肠杆菌细胞中表达9Β8和L27V变体，并通过质谱(MS)进行分析。 [0638] 在ΗΕΚ293细胞和大肠杆菌KRX (Promega Corp.)细胞中将9B8和L27V变体作为N-末端HALOTAG®融合体(对于大肠杆菌细胞为PFN18K ;对于HEK293细胞为pFN21K)来表达并利用 HALOTAG® Protein Purification System (Promega Corp.)根据制造商的说明进行纯化。利用与LTQ Orbitrap Velos质谱仪(Thermo Scientific)连接的C4柱(Waters Xbridge BEH300，3.5 μ m)经由LC/MS分析约5皮摩尔纯化的酶。利用用于检测的 LTQ 从 600-2000m/z 获取数据并利用 MagTranvl.03 软件(Zhang 等，J.Am.Soc.MassSpectrom.,9:225 - 233(1998))进行处理。与未修饰的OgLuc变体(即，不存在任何翻译后修饰)的19，665Da的计算的质量相比较，两种纯化的酶均具有实验上确定的19，666Da的质量。 [0639] 实施例36——OgLuc变体作为转录后报告子的评估 [0640] A.1V [0641] 检查OgLuc变体作为转录后报告子的用途。为生成cAMP的转录后报告子，利用本领域中已知的方法将hRL和IV亚克隆到含芽孢杆菌RNA酶(barnase)序列的修饰的pGL4载体(Promega Corp.)中，所述芽孢杆菌RNA酶序列被感兴趣的DNA片段所替代。修饰的PGL4的前导序列含最低限度启动子和cAMP应答元件(CRE ；SEQ ID NO:96)，从而利用cAMP激动剂诸如毛喉素(FSK)刺激后，积累cAMP的细胞使报告子活化并生成发光。在该实验中，使用hRL或IV转录报告子构建体的2ng DNA如实施例25中所描述的转染HEK293细胞。在转染后24小时，用ΙΟΟμΜ FSK处理细胞。未用FSK处理的细胞用作对照。6小时后，将报告子试剂添加到处理的细胞和对照细胞。对于hRL，报告子试剂为Renilla-Glo™试剂(Promega Corp.)。对于 IV，报告子试剂含 ImM CDTA pH5.5,150mM KCl, IOmM DTT，0.5% TRRGITO1.® NP-9 (v/v) ,20 μ M 腔肠素 _h 和 150mM 硫脲。10 分钟后，在Varioskan® Flash (Thermo Scientific)上阅读发光。 [0642] 图55显示了含用FSK处理的(“+FSK”)或未用FSK处理的(“-FSK”)hRL ( “海肾属”)或IV转录报告子的HEK293细胞的标准化的发光。通过用来自处理的细胞(+FSK)的发光除以来自对照细胞的发光(-FSK)来确定应答，即，发光的倍数诱导或倍数增加(“倍数”)。如图55中所示，关于hRL，应答为〈50，而关于IV其为>300，表明IV作为转录报告子的用途。 [0643] B.9B8 和 9B8opt [0644] 还检查了变体9B8和9B8opt作为转录报告子的用途并如先前关于IV转录报告子所描述的含以下修改与hRL和Luc2转录报告子相比较。如上所述生成含变体9B8或9B8opt的cAMP的转录报告子。在FSK诱导6小时后，从细胞中去除培养基并用实施例25中所描述的100 μ L的裂解缓冲液替换而生成裂解物。如实施例25中所描述的测定用FSK处理或不用FSK处理的转染的细胞的裂解物的发光。用50 μ L的BRIGHT-GL0tmLuc if erase测定试剂测定10 μ L的Luc2裂解物。用含20 μ M天然腔肠素的50 μ L的裂解缓冲液测定10 μ L的hRL裂解物。利用含20 μ M PB1-3939的50 μ L裂解缓冲液测定10 μ L的变体9Β8和9B8opt裂解物。 [0645] 图56显示了用FSK处理(“诱导的”)或未用FSK处理的(“基底”)的含9B8，9B8opt, hRL或Luc2转录报告子的HEK293细胞的标准化的发光。通过用诱导的发光除以基底发光来确定应答，即，发光的倍数诱导或倍数增加(“倍数”)(图56)。虽然倍数诱导值对于除Luc2之外的每个报告子是相似， 由诱导的9B8opt转录报告子生成的发光比诱导的海肾属转录报告子高约2.5对数，且比Luc2转录报告子高约1.5对数。图56显示了 9B8和9B8opt作为转录报告子的用途。 [0646] C.9B8opt 和 9B8opt+K33N [0647] 在裂解转录报告子测定中比较变体9B8opt和9B8opt+K33N。利用本领域中已知的方法将变体9B8opt+K33N克隆到含环状AMP应答元件(CRE) pGL4.29载体(Promega Corp.)中。检验9B8opt+K33N转录报告子并在HEK293细胞中如上所述与9B8opt转录报告子相比较。使用含变体的转录报告子形式的30和IOOng的质粒DNA来转染HEK293细胞。在测量发光前用 FSK诱导细胞5 小时。用含 ImM CTDA, 150mM KCl, 2mM DTT, IOOmM MES pH6.0,35mM 硫脲，0.25% THRCiITO1..® ΝΡ-9 (ν/ν)和10mg/mL2-羟丙基-β -环糊精的裂解缓冲液裂解细胞。在TECAN® GEN10S™Pro光度计上测量发光。用含20 μ M PB1-3939的裂解缓冲液测定裂解物。图57显示了用FSK处理的(“诱导的”)或未用FSK处理的(“基底”)的表达9B8opt或9B8opt+K33N转录报告子构建体的HEK293细胞的标准化的发光(转染校正的)。如图57中所示，当用30ng的DNA转染时9B8opt的倍数诱导为360，和当用IOOng转染时为109，而9B8opt+K33N的倍数诱导分别为275和147。当使用较高的量的DNA转染时，K33N提供了更高的应答。 [0648] D.L27V [0649] 1.如该实施例的C中所描述的将L27V克隆到含CRE，NFkB或HSE (热休克元件)应答元件的报告子载体中。然后如先前所描述的将报告子构建体转染到HEK293细胞或HeLa细胞中。利用关于CRE的FSK、关于NFkB的TNFa或关于HSE的17-AAG诱导细胞。利用含20 μ M PB1-3939的测定试剂如先前所描述的测量发光(图58A-C)。在HEK293，HeLa,NIH3T3，U20S和Jurkat细胞系中验证了全部报告子构建体(数据未示出)。 [0650] 2.如在该实施例的C中所描述的将L27V02和L27V02P(含PEST序列；SEQ IDNO:323)克隆到报告子载体(基于pGL4.32的)中。其他含PEST序列的OgLuc变体包括L27V01-PEST00 和 L27V03-PEST02(分别为 SEQ ID N0:320 和 326)。如先前所描述的然后将报告子构建体转染到HEK293细胞中。然后利用FSK诱导细胞，并利用含20 μ M PB1-3939的测定试剂如先前所描述的测量发光(图59A-B)。还构建了不同的其他报告子构建体并在不同的细胞系中进行了检验(图59C)。图59A显示了 HEK293细胞中对于CRE细胞的全剂量应答。图59B总结了图59B。图59C总结了图59A-B中的数据，并显示了对于NFkB应答元件的相同的数据类型。在HEK293，HeLa, H印G2，Jurkat, ME180, HCTl 16和U20S细胞系中检查了 CRE和NFkB报告子构建体两者。 [0651] 3.利用 FUGENE® HD(Promega Corp.)根据制造商的说明用 pNFkB_L27V 分泌型构建体(SEQ ID N0:463&464 ;其中IL-6分泌序列(SEQ ID N0:461和462)替代了天然 OgLuc 分泌序列 SEQ ID NO:54), Metridia longa(Clontech), pNFkB_L27V(天然分泌序列；SEQ ID NO:465和466)或萤火虫荧光素酶(Luc2 ;基于pGL4.32)质粒DNA转染HEK293细胞(T25烧瓶中0.9xl06个细胞)。在37°C、5%C02下孵育细胞8小时，然后在0.5mLTrypLE(Invitrogen)中胰酶消化。然后将裂解物重悬于含10%FBS，IX NEAA和IX丙酮酸钠的8mLDMEM中。然后将100 μ L的重选的样品添加到96孔平板的孔中并在37°C、5%C02下孵育16小时。` [0652] 孵育后，从细胞中去除培养基并用含TNFa或不含TNF a (连续稀释的)的100 μ L的新鲜培养基替代。为测定分泌，在3小时和6小时时，将5 μ L的培养基(三个重复)从细胞中移去，利用PBS增加到50 μ L并与50 μ L的测定试剂(如先前所描述的含100 μ MPB1-3939)。如先前所描述的在O分钟和10分钟时测量发光(图60)。 [0653] 为测量细长长腹水蚤荧光素酶活性，根据制造商的方案使用Ready-To-Glow™Secreted Luciferase System(Clontech)。 简言之，将 5yLReady-to-Glow™试剂添加到5 μ L样品和45 μ L的PBS中。在添加试剂后立即测量发光(图 60)。 [0654] Ε.L27V优化的变体.[0655]根据制造商的方案利用FUGENE® HD制备用于转染的质粒DNA(pGL4.32-L27V00, pGL4.32-L27V01, pGL4.32-L27V02, pGL4.32-L27V03 和 pGL4.13)。pGL4.32载体(Promega Corp.)含NF-κ B应答元件。L27V密码子优化的序列替代了载体中的Luc2P序列。pGL4.13载体(Promega Corp.)含SV40启动子驱动的Luc2基因。 [0656] 然后将300 μ L的DNA转染混合物与6mL的HeLa细胞悬浮液(2xl05个细胞/mL)相混合，均质化，并将100 μ L接种到96孔板的孔中。然后在37°C、5%C02下过夜孵育细胞。孵育后，将10μ L含BSA的DPBS中的IOX rhTNF α添加到孔中并在37°C、5%C02下孵育4.5小时。6个孔仅用作运载体。然后使细胞在室温下平衡20分钟，且然后添加IOOyL测定试剂(如先前所描述的含100 μ M PB1-3939)。向表达Luc2的细胞或仅接受运载体处理的细胞中添加100 μ L的0NE-GL0™荧光素酶测定试剂。如先前所描述的在添加测定试剂12分钟后测量发光。图61Α-Β显示了绝对发光，图61C-D显示了标准化的发光和图61E-F显示了倍数应答。 [0657] 实施例37——转录报告子测定中的OgLuc变体 [0658] 为证明本发明的OgLuc变体用作转录报告子的能力，将OgLuc变体9B8opt在正向、反向和批量转染中用作转录报告子。选择这些转染根据制造商的方案，因为其代表了基因转录报告子的瞬时表达中常用的方法。 [0659] [H向转染 [0660]在 pGL4.29 (Promega Corp.)骨架中制备了含 cAMP 应答元件(CRE)和 9B8opt 或还包括PEST蛋白降解序列的9B8opt (9B8opt-P)的转录报告子，即，pGL4.29载体的luc2P基因被 9B8opt(SEQ ID NO:24)或 9B8opt_P (SEQ ID NO:65)所替代。pGL4.29 用作对照 / 基准点。 [0661] 将HEK293细胞以15，000个细胞/孔接种在6个96孔组织培养平板中。在100 μ L的DMEM+10%FBS+1X非必需氨基酸(NEAA)中培养细胞并在37°C下孵育过夜。利用pGL4.299B8opt,pGL4.299B8opt_P 或 pGL4.29 的 IOng 或 IOOng 质粒 DNA/ 孔瞬时转染细胞。将质粒 DNA 与 850 μ L 的 OPT1-MEM® (Invitrogen)和 32.4 μ L 的 FUGENE® HD 转染试剂(Promega Corp.)相混合并在室温下孵育10分钟。将8 μ L的转染/报告子DNA混合物添加到适当的孔(2个构建体/平板)。在37 °C下孵育细胞4小时。用OPT1-MEM®+0.5%透析的FBS+1X NEAA+1 X丙酮酸钠+IX青霉素-链霉素替换培养基并在37°C下过夜孵育。 [0662] 孵育后，将含IOnM或10 μ M FSK (来自10Χ贮存液)的ΟΡΤΙ-ΜΕΜ®添加到孔中并在 37°C下孵育 3 小时。将含 IOOmM MESpH6.1，ImM CDTA，150mM KC1，35mM 硫脲，2mMDTT,0.25% Tl'-RCfITOL ® NP-9 (v/v)，0.025% MAZU® DF204 和 20 μ M PB1-3939 的 裂解试剂添加到含pGL4.299B8opt或pGL4.299B8opt_P的细胞中并在室温下孵育10分钟(100 μ L裂解试剂添加到100 μ L细胞中)。将0NE-GL0™测定试剂(Promega Corp.)添加到含pGL4.29的细胞中并根据制造商的方案来使用(100 μ L试剂添加到100μ L细胞)。在GLOMAX®光度计上测量发光。表26显示了用10nM( “基线”)或IOmM FSK处理的表达含CRE的转录报告子的HEK293细胞的发光，和对FSK的应答(B卩，由IOmM FSK处理的细胞生成的发光除以IOnM FSK处理的细胞生成的发光)。 [0663] 表28中显示的结果表明9B8opt和9B8opt_P比luc2P更亮，且当使用IOOng的DNA进行转染时所有荧光素酶报告子对FSK应答。然而，当仅使用IOng的DNA进行转染时，luc2P的发光低于发光计的检测水平。 [0664] 表28:HEK293细胞中含CRE的转录报告子(3小时时间点) [0665] [0666] 反向转染 [0667] 利用本领域中已知的根据制造商的方案在pGL4.29 (Promega Corp.)骨架中制备含抗氧化剂应答元件(ARE)和9B8opt或9B8opt_P的转录报告子，即，pGL4.29载体的luc2P基因被9B9opt或9B8opt-P所替代，和CRE被2X ARE (SEQ ID NO: 66)所替代。 [0668] 用胰酶消化HEK293细胞(T75烧瓶，3mL胰酶)并以IxlO5个细胞/mL (约8.9xl06个总细胞)重悬于含DMEM+10%FBS+1X NEAA的培养基中。通过将1.2mL ΟΡΤ-ΜΕΜ*,12 μ L转录报告子DNA (IOOng)和36 μ L FUGENE® HD转染试剂混合在一起来制备用于转染的每种转录报告子，并在室温下孵育35分钟。孵育后，将624 μ L的转染/报告子DNA混合物添加到12mL的细胞悬浮液中并通过颠倒来混合。混合后，将100 μ L的细胞/DNA混合物添加到96-孔平板的孔中(2个构建体/平板)。在37°C下孵育细胞22小时。将含叔丁基对苯二酚(Nrf2稳定剂；tBHQ ；1 μ M( “基线”)或20 μ Μ)或萝卜硫素(已知活化Nrf2的有机硫化抗氧化剂；I μ Μ(“基线”)或20μΜ)的ΟΡ-ΜΕΜ®添加到每孔并在37°C下孵育24小时。如上关于正向转染所述的利用100 μ L的裂解试剂裂解细胞。在GLOMAX®光度计上测量发光。 [0669] 表29显示了利用I μ M( “基线”)或20 μ M萝卜硫素处理的表达含ARE的转录报告子的ΗΕΚ293细胞的发光和对萝卜硫素的应答(即，通过用由I μ M萝卜硫素处理的细胞生成的发光除以由20μΜ萝卜硫素处理的细胞生成的发光)。表30显示了利用1μΜ(“基线”)或20 μ MtBHQ处理的表达含ARE的转录报告子的ΗΕΚ293细胞的发光和对tBHQ的应答(即，通过用由I μΜ tBHQ处理的细胞生成的发光除以由20 μ M tBHQ处理的细胞生成的发光)。表29和30显示了 9B8opt和9B8opt_P能够报告两种不同的已知的ARE的刺激物的存在。 [0670] 表29:HEK293细胞中含ARE的转录报告子(24小时时间点) [0671] [0672] [0673] 表30:HEK293细胞中含ARE的转录报告子(24小时时间点)[0674] [0675] 批量转染 [0676] 将正向转染中所描述的含CRE和9B8opt或9B8opt_P的转录报告子用于HEK293和NIH3T3细胞的批量转染中。在pGL4.29 (Promega Corp.)骨架中制备含热休克应答元件(HRE ；SEQ ID NO: 67)和 9B8opt 或 9B8opt_P 的转录报告子，S卩，用 9B9opt 或 9B8opt_P 替代pGL4.29的luc2P基因，并用HRE替代CRE。将含HRE和9B8opt_P的转录报告子用于HeLa细胞的批量转染中。 [0677] 在转染前一天将HEK293、NIH3T3或HeLa细胞接种到6孔组织培养平板的单独的孔，密度为对于HEK293细胞为含于3mL完全培养基(DMEM+10%FBS+1X NEAA+1X丙酮酸钠)中的4.5x10s个细胞/孔，对于NIH3T3细胞为含于3mL完全培养基(DMEM+10%胎牛血清(FCS) +IX NEAA+1X丙酮酸钠)中的3xl05个细胞/孔，或对于HeLa细胞为含于3mL完全培养基(DMEM+10%FBS+1XNEAA)中的9.9xl05个细胞/孔。将细胞在37°C下生长过夜。 [0678] 将155 μ L OPT1-MEM® 中的3，300ng的报告子质粒DNA与9.9 μ L FUGENE⑩HD转染试剂相混合，简单涡旋，并在室温下孵育10分钟。使用CRE转录报告子来转染HEK293和NIH3T3细胞。使用HRE转录报告子来转染HeLa细胞。将报告子混合物添加到细胞中并通过轻微摇动来混合，然后在37°C下孵育6小时(HEK293和NIH3T3)或3小时(HeLa)。然后胰酶消化细胞并重悬于培养基(对于HEK293细胞为DMEM+10%FBS+1XNEAA+1X丙酮酸钠，对于NIH3T3细胞为DMEM+10%FCS+1X NEAA+1X丙酮酸钠或对于HeLa细胞为DMEM+10%FBS+1X NEAA)，然后接种到96孔平板的单独的孔(对于HEK293为20，000个细胞/100 μ L，对于ΝΙΗ3Τ3为10，000个细胞/100 μ L，或对于HeLa为13，000个细胞/ μ L)并在37°C下孵育过夜。 [0679] 将含FSK (CRE刺激剂)或17-AAG (HRE刺激剂；17-烯丙氨基-脱甲氧基格尔德霉素)的OPT1-MEM®添加到细胞(对于FSK为IOnM或10 μ M终浓度；对于17-AAG为InM或I μ M终浓度17-AAG)中并在37°C孵育4小时(FSK)或6小时(17-AAG)。从孵育器中移出平板并使其平衡至室温，持续25分钟。如上关于正向转染所述的用IOOyL裂解试剂裂解细胞。在GLOMAX®光度计上测量发光。 [0680] 表31显示了用10nM( “基线”)或IOmM FSK处理的表达含CRE的转录报告子的HEK293细胞的发光，和对FSK的应答。表32显示了用IOnM(“基线”)或IOmM FSK处理的表达含CRE的转录报告子的NIH3T3细胞的发光，和对FSK的应答。表33显示了用IOnM(“基线”)或10mM17-AAG处理的表达含HRE的转录报告子的HeLa细胞的发光，和对17-AAG的应答。 [0681] 表29-31显示了 I)在两种不同的细胞系HEK293和NIH3T3的环境中，9B8optOgLuc变体的两种形式可报告FSK的存在和FSK对CRE的刺激作用，和2)在HeLa细胞的环境中，9B8optP可报告17-AAG的存在和17-AAG对HRE的刺激作用。[0682] 表31:HEK293细胞中含CRE的转录报告子(4小时时间点) [0683] [0684] 表32:NIH3T3细胞中含CRE的转录报告子(4小时时间点) [0685] [0686] 表33 =HeLa细胞中含HRE的转录报告子(6小时时间点) [0687] [0688] 实施例38——难以表达的细胞中的裂解的和分泌的报告子 [0689]根据制造商的说明利用 FUGE+NE® HD 利用含 L27V02、luc2P (Promega Corp.)、luc2 (Promega Corp.)或L27V02-1L6 (含被IL-6分泌序列替代的天然分泌序列的L27V02 ；(<<IL601-L27V02A,> ；SEQ ID NO:324)的质粒 DNA (pGIA 32 骨架，Promega Corp.)对细胞悬浮液中的IxlO5个细胞/mL的HepG2细胞进行逆向转染(1: 20DNA-转染混合物比细胞)。然后将100 μ L细胞悬浮液接种到96孔板的孔中并在37°C、5%C02下孵育22小时。其他具有被IL-6分泌序列替代的天然分泌序列的OgLuc构建体包括IL601-L27V01和IL602-L27V03(分别为 SEQ ID NO:321 和 327)。 [0690] 对于分泌分析，从细胞中移除培养基，并在100μ L DPBS中洗涤细胞。添力口 100μ L 完全培养基(DMEM+10%FBS+1X NEAA)和不同剂量(lpg/mL-100ng/mL)的rhTNF a (“TNF α，，)，持续4.5小时。移出10 μ L的培养基，向其添加90 μ L的完全培养基，并添加100 μ L的测定试剂(如先前所描述的；100 μ M PB1-3939)。如先前所描述的测量发光(图62A)。 [0691] 对于裂解分析，在接种后，将细胞在37°C、5%C02下孵育4.5小时。然后使细胞平衡至室温，持续20分钟。向细胞添加测定试剂(如先前所描述的；100μΜ PB1-3939)，并如先前所描述的测量发光(图62B)。[0692] 实施例39——其他的裂解报告子特征 [0693] 在基于细胞的环境中，本发明的OgLuc变体，裂解转录报告子应提供一定强度的发光信号从而信号出现得比其可能与其他荧光素酶出现得更快。该明亮发光也允许检查弱启动子。 [0694] 实施例40——哺乳动物细胞转染 [0695] 本发明的OgLuc变体在难以转染的细胞系中用作报告子，例如，Jurkat, H印G2，原代细胞，不分裂的原代细胞或干细胞(参见，图59C)。由于其高信号强度，当转染效率低时，OgLuc变体能够使发光可检测。OgLuc变体还可用作尤其对与转染相关的条件(即,DNA浓度，转染试剂添加)敏感的细胞中的报告子。由于OgLuc变体的亮度，利用较低的DNA浓度、较少的转染试剂和可能更短的开始测定前的转染后时间而可获得足够水平的发光。这将使敏感型细胞可能承受的毒性负担更少。在诸如需要输出的事件中，OgLuc变体的明亮发光还应允许在非常长的时间点检测信号。作为另一例子，OgLuc变体可能用作用于单拷贝天然启动子的报告子，例·如，HSB胸苷酸激酶(TK)启动子，HOX基因或LIN28。 [0696] 实施例41——稳定的细胞系 [0697] 荧光素酶的明亮信号和OgLuc基因的小尺寸可有利于表达本发明的细胞质形式或分泌形式的OgLuc变体的稳固的、稳定细胞系的鉴定。该相对小的基因序列应降低由于外源DNA的整合导致的基因不稳定性的可能性。 [0698] 为利用本发明的OgLuc变体生成稳定的细胞系，使用包括OgLuc变体和选择性标志物基因(例如，新霉素、潮霉素或嘌呤霉素)的核苷酸序列的质粒DNA来转染感兴趣的细胞系，例如，HEK293细胞。将早期传代数目的细胞，例如，10代以下，接种到T25(lxl06)或Τ75(3χ106)组织培养烧瓶中并允许其生长过夜至约75%汇合。然后利用以上质粒DNA和适当的转染试剂，例如，TRANSIT®-LT1或FUGENE® HD来转染细胞。转染后48小时，用含先前确定杀死未转染的细胞的浓度的选择药物例如G418、潮霉素或嘌呤霉素的选择培养基替换细胞培养基。2-4周后选择含质粒DNA的细胞。在此期间，以不同的浓度将细胞再接种到T25或T75组织培养烧瓶的选择培养基中。每3-4天用新鲜选择培养基替换再接种的细胞上的培养基，持续2-3周。监测烧瓶的活细胞克隆的形成。最终，烧瓶将含许多大型克隆和极少的死细胞。 [0699] 从烧瓶中的稳定克隆的混合物中，分离单克隆并扩增到单独的24孔组织培养板中。简言之，利用胰酶/EDTA方法收获细胞，即，通过去除培养基，用不含Ca2+和Mg2+的PBS漂洗并通过用胰酶/EDTA处理来分离而收获细胞。利用血球计来计数细胞并将IxlO5稀释于完全培养基中。然后将细胞在完全培养基中稀释至100个细胞/mL，33细胞/mL，10个细胞/mL和3.3个细胞/mL。将100 μ L的每个稀释液接种到96孔组织培养平板的所有孔中(每个稀释液I平板)并允许生长4-5天，之后将50 μ L的选择培养基添加到细胞。接种约I周后，目测筛选细胞的克隆生长并添加另一 50 μ L的选择培养基。继续监测细胞直至单克隆覆盖孔面积的40-60%。当克隆即将扩增和筛选时，利用胰酶/EDTA方法收获克隆。如下将每个克隆转移到选择培养基中:1)1:10稀释到用于功能测定(例如，发光检测)的96孔测定板的6个孔中；2) 1:10稀释至用于细胞生存力测定(例如，CELLTITER- GLO⑩Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corp.))的透明底 96 孔测定平板的 3 个孔中；3) 1:10稀释到用于扩增的24孔组织培养平板中。然后将用于功能测定和细胞生存力测定的平板中的细胞培养2-3天并进行功能测定和细胞生存力测定。然后利用功能测定和细胞生存力测定进一步检验24孔平板中的阳性克隆并检验表达的稳定性和应答至少20代，正常生长速率形态，并在最早的可能传代时冷冻以用于将来使用。 [0700] 实施例42——OgLuc分泌信号分析 [0701] A.1V opt [0702] 在合成后将野生型OgLuc加工为分泌信号序列裂解掉的成熟蛋白。为确定该分泌信号序列是否将协助OgLuc变体的分泌，将实施例25的IV opt变体和hRL克隆到含N-末端OgLuc分泌信号(SEQ ID NO: 54)的pF4Ag中。利用IOOng的质粒DNA，S卩，含有或不含分泌信号的hRL或IV opt的质粒DNA如实施例25中所描述的转染含10%胎牛血清(FBS)的100 μ L达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(“DMEM”)中的ΗΕΚ293细胞(15，000)并在37°C下生长过夜。将50 μ L的培养基移出到新平板中并保存以用于稍后的测定，生成“培养基”样品。去除剩余的培养基，并用实施例25中描述的100 μ L的裂解缓冲液裂解细胞而生成“裂解物”样品。测定ίο μ L培养基样品和10 μ L裂解物样品的发光(图63)。利用含20 μ M天然腔肠素的50 μ L裂解缓冲液测量含OgLuc分泌信号序列(“Renilla sig”)或不含OgLuc分泌信号序列(“Renilla”)的hRL的样品。利用含20 μ M PB1-3939的50 μ L裂解缓冲液测量含OgLuc分泌信号序列(“IV opt sig”)或不含OgLuc分泌信号序列(“IVopt”)的IV的样品。 [0703] 在图63中，实心条代表在不存在任何裂解试剂的情况下从培养基中检测的光的量。空心条代表在添加裂解试剂后检测的总光(分泌的+非分泌的)。图63显示了 IV opt从HEK293细胞中分泌到生长培养基中且分泌信号序列在哺乳动物细胞中是功能性的。“ IVopt sig”代表在培养基中 检测到荧光素酶的显著的量的唯一情况。结果还表明该特定的信号肽不会协助hRL的分泌。 [0704] B.9B8, V2 和 L27V [0705] 为确定OgLuc的分泌信号序列是否协助其分泌，将OgLuc变体9B8，V2和L27V克隆到含N-末端OgLuc分泌信号序列的pF4Ag中。还将变体克隆到不含分泌信号序列的载体中。然后将CHO或HeLa细胞以100，000个细胞/孔接种到12孔平板的含10%FBS和IX丙酮酸钠的ImL的F12培养基(CH0细胞)或含10%FBS和IX丙酮酸钠的DMEM (HeLa细胞)中并在37°C、5%C02下孵育过夜。 [0706] 过夜孵育后,利用TRANSIT®-LT1转染试剂(Mirus Bio)和OFT1-MEM⑩培养基(Invitrogen)利用具有或没有分泌信号序列的含9B8，V2或L27V的I μ g DNA转染细胞。再次将细胞在37°C、5%C02下孵育过夜。 [0707] 第二次过夜孵育之后，移出培养基并保存以用于分析。向细胞中添加ImL的测定缓冲液(ImM CDTA，150mM KCl, 2mM DTT, IOOmM MES ρΗ6.0，35mM 硫脲和 0.5% TERGITOL® NP-9 (v/v))以生成细胞裂解物。向来自每个样品的10 μ L的细胞裂解物或保存的培养基中添加50 μ L的含40 μ M PB1-3939的测定缓冲液，并如上所述测量发光。图64A-D表明9B8，V2和L27V变体可用于可分泌系统。 [0708] 为确定分泌的变体的稳定性，将来自每个样品的150 μ L等份的保存的培养基置于37°C或50°C下。然后在不同的时间点(0，1，2，3，5，6和7分钟)移出等份，在干冰上冷冻，并在-20°C保存直至测定。为测定稳定性，将培养基等份融化至室温，并如上所述将10 μ L的每个等份与含PB1-3939 (pH6.0)的测定缓冲液相混合。如上测量发光，并确定半衰期(t5Q)(表 34)。 [0709]表 34 [0710] [0711] C.9B8和V2关于细长长腹水蚤的分泌的荧光素酶的比较 [0712] OgLuc变体9B8和V2关于来自细长长腹水蚤的分泌的荧光素酶的分泌进行比较。将CHO细胞以300，000个细胞/孔接种于6孔平板的孔中的含10%FBS的3mL F12培养基中并在37°C、5%C02下过夜孵育。然后根据制造商的说明利用TRANSFT®-LTI利用10或IOOng的每个变体或长腹水蚤属荧光素酶(Clontech)质粒DNA转染细胞，并在37°C、5%C02下孵育20小时。转染后，从细胞中移出培养基并测定。对于OgLuc变体，利用50 μ L的测定试剂(先前所描述的；40 μ MPB1-3939)测定50 μ L的培养基。对于长腹水蚤属荧光素酶，根据制造商的方案利用 Ready-to-Glo™Secreted Luciferase Reporter System(Clontech)测定培养基。简言之，将5 μ L的IX底物/反应缓冲液添加到50 μ L的培养基样品中。然后如先前所描述的测量发光(图65Α-Β)。 [0713] 实施例43——活细胞中的OgLuc变体和新型腔肠素的评估 [0714] Α.检查活细胞中的OgLuc变体和ΡΒΙ-3939的用途。将ΗΕΚ293细胞以15，000个细胞/孔接种在96孔平板中并在37°C下生长过夜。第二天，利用IOOng的含hRL或9B8opt的pF4Ag以三个重复利用TRANSIT®-LTl瞬时转染细胞并在37°C下生长过夜。第二天移除生长培养基并用含 60μΜ VIVIREN™Live Cell Substrate (Promega Corp.), 60 μ MENDURENtmLive Cell Substrate (Promega Corp.)或用于 hRL 和 9B8opt 转染的细胞两者的60 μ M PB1-3939的培养基替代。未转染的细胞用作背景对照。在一天的过程中在37°C下孵育平板并在TECAN® GENIOS™ Pro光度计上周期性地测量，即，在24小时的过程中进 行11次。图66A-B显示了对于每种底物，转染的细胞的发光除以未转染的细胞的发光，即，信号比背景比率。数据显示了通过用VIVIREN™，ENDUREN™或PB1-3939孵育细胞活细胞背景中(即，未裂解)的9B8opt生成的发光。数据还表明PB1-3939能够渗透培养中的细胞，与OgLuc变体反应并生成发光，从而使其与活细胞测定中的用途兼容。 [0715] B.为利用OgLuc变体证明活细胞分析，将L27V与HALOTAG®融合并在活细胞中表达和监测。将U20S细胞以40，000个细胞/mL接种到成像室孔中并在37°C、5%C02下过夜孵育。然后利用含L27V的质粒pFC14K，pFN21K或pF4Ag(均为Promega Corp.)或含具有天然的或IL-6分泌序列的L27V的pF4Ag根据制造商的方案利用FUGENE® HD转染细胞。然后在37°C、5%C02下孵育细胞24小时。 [0716] 孵育后，将细胞与HALOTACVX: TMR配体(Promega Corp.)接触，成像并固定。然后根据HALOTAG⑩ 技术中的ICC方案:聚焦成像技术手册(Promega Corp.；TM260)进行免疫细胞化学(ICC)。使用的一抗为多克隆兔，抗0gLuc9B8抗体(1:1000)。使用的二抗为与二抗缀合的Alexa488(绿色)(图67A)。图67A显示了绿色荧光通道和图67B显示了差示干涉相差(DIC)。利用装备有37°C+CO2环境室(Solent Scientific Ltd., UK)的Olympus Fluoview FV500 共聚焦显微镜(Olympus, USA)获取图像。 [0717] 图67B-D显示了具有天然的或IL_6分泌序列的ICC图像。两种信号序列显著地提高了核内的酶的量。在细胞质中的标记的强调的性质代表预期在分泌过程中发生的囊泡形成。数据表明信号肽的存在降低了核内的荧光素酶的量。 [0718] C.如上所示，本发明的OgLuc变体和新型底物是生物相容的。设想了其中将OgLuc变体克隆到含感兴趣的启动子的表达载体中并在细胞中作为报告子蛋白而表达的报告子系统。然后利用将渗透培养中的细胞的PB1-3939来处理细胞，使细胞与OgLuc变体反应，并生成发光。 [0719] 除作为细胞渗透物之外，PB1-3939在细胞生存力方面显示了与天然腔肠素相当的生物相容性。可以合成已知在培养基中提高天然腔肠素的稳定性的含化学修饰的化合物3939的一种形式，并用于稳固的，基于活细胞OgLuc变体的报告子测定。活细胞报告的另一例子包括使用可分泌的OgLuc变体作为报告子。可将天然的分泌信号肽(或其他已知的分泌信号肽)与OgLuc变体的N-末端融合从而当融合体在哺乳动物中表达时，其部分将通过细胞膜分泌到培养基中。在添加底物后生成发光。 `[0720] 实施例44——蛋白融合报告子 [0721] 本发明的OgLuc变体可用作感兴趣的靶蛋白的融合标签，作为监测该靶蛋白的细胞内水平的手段。可在细胞中监测参与应激应答途径的特定的蛋白，例如，DNA损伤、氧化应激，炎症，作为探查不同类项的刺激物可能在这些途径中所起作用的手段。变体还可用作监测靶蛋白的细胞运输的工具。变体还可与病毒基因组(例如，HIV，HCV)融合从而在用潜在的抗病毒剂处理后可在细胞中监测滴度水平，即，传染力。变体还可与绿色荧光蛋白(GFP)或HALOTAG® (除靶蛋白之外)融合从而FACS可用于鉴定高表达克隆和提供定位信肩、O [0722] 实施例45——3-组件融合蛋白(“三明治”)中的OgLuc变体的评估 [0723] 3-组分融合蛋白或“三明治”融合体，可用于将生物发光蛋白和荧光蛋白置于相互靠近以优化基于BRET的生物感受器。 [0724] A.C1+4AE, IV, 9B8 和 9F6 [0725] 利用已知为较差融合伴侣的N-末端Id(Benezra等,Cell, 61 (I):49-59 (1990))和用于标准化的 C-末端 HT7 将 OgLuc 变体 C1+4AE(SEQ ID NO: 55 和 56)，IV (SEQ ID NO: 57 和58), 9B8 (SEQ ID NO: 61 和 62)和 9F6 (SEQ ID NO: 63 和 64)和 hRL(SEQ ID NO: 32 和 33)克隆到pF4Ag融合载体中。将感兴趣的基因在Id和HT7之间(即，Id-荧光素酶-HT7) “三明治化”，如实施例26中所描述的制备含pF4Ag或pF4Ag三明治背景中的变体构建体的大肠杆菌裂解物，且然后用实施例25中所描述的缓冲液中的20 μ M天然腔肠素进行测定。 [0726] 图68显示了在pF4Ag或pF4Ag背景(“三明治”)中每个变体的发光。图69显示了由于Id和HT7的存在发光的倍数增加，并通过用pF4Ag中的变体的发光除以pF4Ag-三明治中的变体的发光来确定。具有最大值的样品显示了对于较差融合伴侣Id的最强的敏感性。变体9B8是三明治环境中最亮的。 [0727] B.9B80PT 和 9B80PT+K33N [0728] 如先前所描述的在三明治背景中分析变体9B8opt和9B8opt+K33N。如先前所描述的生成 9B8opt(SEQ ID N0:40 和 41)和 9B8opt+K33N(SEQ ID N0:59 和 60)的三明治构建体。利用与用于生成图40所用的相同的测定缓冲液和光度计测定并且测量大肠杆菌裂解物。图70显示了在三明治背景存在下的倍数增加，表明9B8opt+K33N不如9B8opt对较差融合伴侣Id更敏感。 [0729] C.23D2 和 24C2 [0730] 将变体23D4(NF)和24C2 (NF)亚克隆到Id-0gLuc_HT7三明治背景中并在大肠杆菌中进行测定。将三明治变体23D4(F) (SEQ ID N0:76和77)和24C2 (F) (SEQ ID NO:7879)与三明治背景中的9B8opt+K33N(SEQ ID N0:59和60)相比较。表35显示了在三明治背景环境中变体具有与9B8opt+K33N至少相同的发光。 [0731] 表35:由OgLuc变体生成的发光与三明治背景中的9B8opt+K33N+170G相比较的 增加 [0732] [0733] D.1F7 和 15H1 [0734] 筛选与三明治背景中的9B8opt+K33N相比较Id-0gLuc_HT7三明治背景中的PCR文库的具有增高的发光的另外的变体。然后在HEK293细胞和NIH3T3细胞中测定选择的变体。表36显示了在大肠杆菌细胞、HEK293细胞和NIH3T3细胞中三明治变体的发光的倍数增加和在变体中发现的氨基酸置换。1F7 (F) (SEQ ID NO: 84和85)和15H1 (F) (SEQ IDNO:86和87)在大肠杆菌中具有至少1.3倍增加的发光。在HEK293细胞和NIH3T3细胞中1F7 (F)比在三明治背景中的9B8opt+K33N更亮。 [0735] 表36:由OgLuc变体生成的发光与三明治背景中的9B8opt+K33N相比较的增加 [0736] [0737] 将三明治变体克隆到基于pF4Ag的非融合背景载体中以生成1F7 (NF) (SEQID NO:80和81)和15H1 (NF) (SEQ ID NO:82和83)并如先前所描述的进行分析，并与9B8opt+K33N相比较。表37显示了在大肠杆菌细胞、HEK293细胞和NIH3T3细胞中变体的发光的倍数增加。在大肠杆菌和HEK293细胞中1F7(NF)和15H1 (F)具有至少1.3倍数增加的发光。 [0738] 表37:由OgLuc变体生成的发光与三明治背景中的9B8opt+K33N+170G相比较的 增加 [0739] [0740] E.V2,9B8opt+K33N+L27V+K43R+Y68D,9B8opt+K33N+L27V+T39T+K43R+S66N 和L27V [0741]如先前所描述的将变体 9B8opt+K33N+T39T+K43R+Y68D( “V2” ；SEQ ID N0:92 和93)，9B8opt+K33N+L27V+K43R+Y68D(SEQ ID NO:339 和 340)，9B8opt+K33N+L27V+T39T+K43R+S66N(SEQ ID N0:341 和 342)和 9B8opt+K33N+L27V+T39T+K43R+Y68D( “L27V” ；SEQ IDNO:88和89)亚克隆到Id-0gLuc-HT7三明治背景中并如先前所描述的在HEK293和NIH3T3细胞中进行测定。将由三明治变体生成的发光与由9B9opt+K33N三明治(SEQ ID N0:59和60)生成的发光相比较(表38)。L27V三明治(SEQ ID N0:90和91)和V2三明治(SEQ IDNO:94和95)在HEK293细胞和NIH3T3细胞中具有至少1.3X倍数增加的发光。 [0742] 表38:由三明治背景中的OgLuc变体生成的发光与三明治背景中的9B8opt+K33N相比较的增加 [0743] [0744] 如实施例37中所描述的在HEK293细胞和NIH3T3细胞中测定变体V2，9B8opt+K33N+L27V+K43R+Y68D, 9B8opt+K33N+L27V+T39T+K43R+S66N 和 L27V 的三明治和非三明治形式。将由非三明治的变体生成的发光与由三明治变体生成的发光相比较(表39)。表39中所示的数据表明9B8opt+K33N三明治的发光的倍数降低在哺乳动物细胞中比在大肠杆菌细胞中更低，如图70中所示。 [0745] 表39:在三明治背景存在下OgLuc变体的发光的倍数降低 [0746] [0747] 实施例46——多重复合 [0748] A.如先前在实施例27中所描述的制备表达变体9B8opt的大肠杆菌的裂解物并在不含酚红+0.1% PRIONEX®的DMEM中稀释1000倍。利用修改的DUAL-GLO®Luciferase Assay System (Promega Corp.)检测来自含6.3 μ g/mL的纯化的红色叩头虫突光素酶的样品的发光和表达变体9B8opt的大肠杆菌裂解物的发光。根据制造商的方案，使用含 20 μ M 腔肠素-h 的 DUAL-GLO® STOP& GLO CD Reagent 和含 20 μ M ΡΒΙ3939 的DUAL- GLO® STOP&GLO® Reagent来检测来自单一的样品的红色叩头虫荧光素酶和OgLuc变体9B8突光素酶。进行三个重复。 [0749] 在Turner MODULUS™光度计上检测发光。表40显示了由红色叩头虫荧光素酶(“叩头虫”)生成的平均发光，和由9B8opt( “OgLuc”)利用腔肠素_h( “腔肠素h”)或PB1-3939( “3939”)生成的发光。还显示了标准偏差(“+/-，，)和变异系数(“CV”)。进行“无腔肠素”对照以示出在不存在腔肠素的情况下由DUAL-(〖U'H Luciferase AssaySystem的DUAL-GLO® STOP&GLO® Reagent所淬灭的红色叩头虫信号的量。“无腔肠素”对照产生了 349倍淬灭。表40显示了在单一样品中检测的来自红色叩头虫和OgLuc变体9B8两者大型发光信号。这表明每种信号可在两步测定中相继读出，且来自第一种酶的信号可被足够淬灭而不会显著地影响来自第二种酶的信号。 [0750] 表40:利用修改的DUAL-LUCIFERASE™报告子测定由红色叩头虫和9B8opt荧光素 酶生成的平均发光 [0751] [0752] B.为证明如上所述的多重复合报告子测定可反向进行，即，首先检测OgLuc发光，淬灭并检测第二发光，例如，红色叩头虫或荧光素酶荧光素酶，筛选了多种海肾属荧光素酶抑制剂(参见美国公布申请第2008/0248511号)同样抑制OgLuc的能力。将两种不同的先前鉴定的海肾属抑制剂PB1-3077和1424以不同的浓度(参见表41)添加到表达变体9B8的大肠杆菌裂解物样品(如上稀释的)和含IOOmMMES pH6.0, ImM CDTA，150mM KCl，35mM硫脲，2mM DTT，0.25% TERGITOL® NP-9 (v/v)，0.025% MAZU® DF204 和 20 μ MPB1-3939 的缓冲液中。如先前所描述的测量发光，不同的是利用GLOMAX(R)-MuIti Microplate光度计(Promega Corp.;也称作Turner MODULUS™)测量发光。如表41中所示,两种化合物均能够抑制OgLuc发光。这表明在报告子测定中OgLuc变体可与另一荧光素酶进行多重复合，其中在报告子测定中首先检测来自OgLuc变体的发光。 [0753] 表41:PB1-3077和PB1-1424对由利用PB1-3939作为底物的表达9B8opt的细菌裂解物生成的发光的作用 [0754] [0755] C.分析OgLuc变体L27V和萤火虫荧光素酶(Fluc)之间的光谱分辨率。将不含酚红+0.1% PRIONEX®的DMEM中的纯化的L27V(先前所描述的；9.54pM)与含20 μ MPB1-3939的测定试剂(先前所描述的)相混合。将相同培养基中的纯化的萤火虫荧光素酶(QUANTILUM®重组突光素酶；Promega Corp.；271ng/mL)与检测试剂(IOOmM HEPES，ρΗ7.4，ImM CDTA, 16mM MgS04,1% TERGITOL® NP-9 (v/v), 0.1% MAZU® DF204,5mM ATP，50mMDTT，333yM 荧光素)相混合。将 IX Renilla Luciferase Assay LysisBuffer (Promega Corp.)中的纯化的海肾属荧光素酶(5ng/mL GST-海肾属)与海肾属荧光素酶测定缓冲液中的10.5 μ M天然腔肠素相混合。3分钟后测量L27V和Fluc的发光和10分钟后测量海肾属荧光素酶的发光(图71)。 [0756] D.作为另一个例子，本发明的OgLuc变体可用作转录报告子并与水母发光蛋白或cAMP循环交换的萤火虫荧光素酶生物感受器(或与两者同时地)配对以在单一样品中检测多个途径，例如，用于检测和/或测量钙的水母发光蛋白，用于检测和/或测量cAMP的生物感受器，和用于监测下游基因表达的OgLuc变体。 [0757] E.与本发明的OgLuc变体多重复合的其他例子包括: [0758] i)利用含本发明的OgLuc变体和萤火虫荧光素酶的构建体转染细胞。转染后，可添加第一试剂以裂解细胞并提供底物以生成第一荧光素酶的发光。然后可测量来自第一荧光素酶的发光。然后可添加第二试剂以淬灭来自第一突光素酶的发光并提供底物以从第二荧光素酶生成发光。然后可测量来自第二荧光素酶的发光。选择哪种荧光素酶首先测量将仅取决于利用第二试剂淬灭来自第一荧光素酶的发光的能力。对于该例子，可首先测量来自OgLuc变体的发光，由于已显示高浓度的荧光素(萤火虫荧光素酶的底物)抑制OgLuc变体的活性。 [0759] ii)利用含本发明的OgLuc变体和萤火虫荧光素酶的构建体转染细胞。转染后，可添加第一试剂，其含有活细胞底物以生成第一荧光素酶的发光。然后将测量来自第一荧光素酶的发光。然后添加第二试剂以裂解细胞，淬灭来自第一荧光素酶的发光并提供底物以生成来自第二荧光素酶的发光。然后将测量来自第二荧光素酶的发光。这与i)相似，不同的是细胞裂解将进一步限制活细胞底物的使用并有利于淬灭来自第一荧光素酶的发光。 [0760] iii)利用本发明的OgLuc变体和萤火虫荧光素酶的构建体转染细胞。转染后，可添加一种试剂，其含有底物以从两种突光素酶生成发光，但来自每种突光素酶的发光在光谱上不同的。OgLuc变体的发射最大值为约460nm和萤火虫荧光素酶的某些底物，例如，5’-氯代荧光素和5’-甲基荧光素,可产生约610nm的发射最大值。因此,从蓝色发射到红色发射可能有一些重叠，从红色发射到蓝色发射可能无重叠，表明可能极少涉及或不涉及数学校正。[0761] iv)利用含本发明的OgLuc变体和萤火虫荧光素酶的构建体转染细胞。转染后，可添加一种试剂，其含有活细胞底物以从两种荧光素酶生成发光。该例子的独特的特征是在活细胞测定温度下，例如，37°C，萤火虫发光趋向于转变为红色，因此，可选择大量不同的荧光素衍生物作为萤火虫荧光素酶的活细胞底物以生成发光，其在光谱上不同于OgLuc变体。 [0762] V)利用含本发明的OgLuc变体和海肾属荧光素酶的构建体转染细胞。转染后，可添加第一试剂以裂解细胞并提供底物以生成第一荧光素酶的发光。然后将测量来自第一荧光素酶的发光。然后将添加第二试剂以淬灭来自第一荧光素酶的发光并提供底物以生成来自第二荧光素酶的发光。然后将测量来自第二荧光素酶的发光。选择哪种荧光素酶首先测量仅取决于利用第二试剂淬灭来自第一荧光素酶的发光的能力。对于该例子，需要使用淬灭OgLuc变体或海肾属荧光素酶发光的抑制剂。 [0763] vi)利用含本发明的OgLuc变体和叩头虫荧光素酶的构建体转染细胞。转染后，可添加一种试剂，其含底物以从两种荧光素酶生成发光，但来自每种荧光素酶的发光在光谱上是不同的，因为叩头虫荧光素酶利用天然荧光素生成红移发光。 [0764] 实施例47——循环交换 [0765] 生成了 L27V变体的两种循环交换(CP)形式:CP84和CP95。数字标号指N-末端残基(例如，“84”表示CP形式的新的N-末端)。 [0766] 为构建循环交换，利用无接头(“CP84无接头” (SEQ ID N0:97和98)和“CP95无接头” (SEQ ID NO: 105 和 106))或 5 个(“CP845AA 接头” (SEQ ID NO:99 和 100)和“CP955AA 接头”(SEQ ID NO: 107 和 108)，10 个(“CP8410AA 接头”(SEQ ID NO: 101 和 102)和“CP9510AA 接头”(SEQ ID NO: 109 和 110)或 20 个(“CP8420AA 接头”(SEQ ID NO: 103 和104)和 “CP9520AA 接头” (SEQ ID NO: 111 和 112)氨基酸接头，(GSSGG)n (SEQ ID NO: 113)在N-末端和C-末端之间将先前的N`-末端和C-末端融合在一起。(注意:L27V在N-末端起始于苯丙氨酸，即，MVF。“MV”存在于“无接头”构建体中，但不存在于“接头”构建体中)。循环交换后，将CP L27V变体克隆到pFIK载体中。利用先前所描述的标准走开诱导方案利用CP载体转化大肠杆菌细胞并在最低限度培养基中培养。对于每个CP构建体，将细胞生长于96孔平板的8个孔中。诱导后，混合来自每个样品的8个孔，并将IOyL裂解于 40 μ L 裂解缓冲液中(IOOmM MES pH6.0,0.3Χ PLB，0.3mg/mL 溶菌酶，0.003U/μ L DNA酶I和0.25% TnRCiI TOL ii' NP-9 (v/v))。然后将裂解物以1:100(具有接头的CP形式)或1:1000(无CP的形式)稀释于裂解缓冲液中。不稀释无接头的CP形式。在50 μ L测定试剂中以三个重复测定裂解物或裂解物稀释(先前所描述的)。如先前所描述的测量发光(图 72)。 [0767] 实施例48—鉴定循环交换的其他位点 [0768] 为鉴定其他CP位点，确定CP位点对荧光素酶活性的影响并研究片段之间的“系链”的用途，生成了在L27V变体的约每第三个位点(即，氨基酸)处具有循环交换的CP构建体(参见图73Ε)。本领域中的技术人员将理解其他位点，例如，第一位点和第二位点，也可被检验并利用本文所描述的根据制造商的方案用于本文所描述的循环交换OgLuc变体中。例如，已发现L27V变体对于循环交换尤其容许，尤其是在交换的片段(例如，基于cAMP/RIIbB的感受器)之间放置相对大的结合结构域的情况。在每个位点处,添加了接头GSSGG-GSSGG-EPTT-ENLYFQS-DN-GSSGG-GSSGG(SEQ ID NO:328) „ 下划线的序列指 TEV 蛋白酶识别位点。接头的目的是为了在两个变体片段之间提供足够长的系链从而其可以产生功能性荧光素酶的方式相连接。使用TEV蛋白酶识别位点来提供破坏系链的工具(在TEV蛋白酶存在下)从而可研究其维持活性的重要性。TEV蛋白酶识别位点的使用构建了模型以预测哪个CP位点将对于蛋白互补测定(PCA)是有用的或对于生物感受器应用是有用的(例如，在CP位点之间插入应答元件)。 [0769] 在TEV裂解之前所见的活性代表变体酶的两半在系链状态中的表现如何。TEV与识别位点的结合导致裂解，从而将变体酶的两半分开。利用TEV已裂解的样品将代表未诱导的状态并提供了多少背景可预期的指示。TEV裂解后较低的活性表示两半不能在无诱导的情况下连接在一起。TEV裂解后显示活性的大量丢失的样品表示将在PCA和生物感受器应用中起作用的位点。在PCA的情况下，变体酶的两半将与能够在诱导的结合事件之后连接(系链)的结合伴侣融合。在生物感受器的情况下，在结合诱导的构象改变发生后两半将“系链”。PCA的一个例子将为使L27V的一半与FRB融合和另一半与FKBP融合。在暴露于雷帕霉素时将使两半接近(Banaszynski 等，J.Am.Chem.Soc, 127(13):4715 - 4721 (2005))。生物感受器应用的一个例子将是在CP位点之间插入环状的AMP结合结构域(例如，RIIbB)并通过环状AMP与结合结构域的结合而诱导构象改变。 [0770] 生成每个CP L27V构建体后，在小麦胚芽、大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达CP酶并利用TEV蛋白酶消化以研究荧光素酶活性。 [0771] 1.为在小麦胚芽中进行分析，根据制造商的说明利用TUT® T7Coupled WheatGerm Extract System (Promega Corp.)表达 CP 构建体。将 ΤϋΤ®.反应物以 1:100 稀释于IX PBS+0.1%明胶中并将20 μ L添加至IJ 25 μ L的TEV反应试剂(5 μ L20X ProTEV缓冲液(Promega Corp.), I μ LlOOmM DTT 和 2 μ LlOU ProTEV Plus (Promega Corp.))。利用水将消化反应物的体积增加至100 μ L，并在30°C下孵育60分钟。还制备了不含TEV蛋白酶的对照样品。然后将IOyL的消化的样`品添加到40 μ I DMEM，至50 μ L的终体积，并在50 μ L的测定试剂中测定(如先前所描述的；100μΜ PB1-3939)。如先前所描述的测量发光(图73A-D)。 [0772] 2.为在哺乳动物细胞中进行分析，利用反向转染方案利用CPL27V变体转染HEK293细胞。简言之，将Ing CP L27V质粒DNA与I μ g载体DNA相混合并添加到12孔平板的孔中的细胞中。然后将细胞在37°C、5%C02下孵育16小时。然后通过从细胞中去除培养基来制备细胞裂解物，在IX PBS中洗涤细胞并添加ImLlX PLB。然后在含0.1%明胶的IX PBS中1:10稀释裂解物。然后如先前所描述的将40 μ L的稀释的裂解物用于TEV蛋白酶消化中。将10 μ L的消化与40 μ L的不含酚红的DMEM混合，并添加50 μ L的测定试剂(先前所描述的；100 μ M PB1-3939)。如先前所描述的测量发光(图73H)。 [0773] 3.为在大肠杆菌中进行分析，在30°C下生长过夜表达CP L27V变体的大肠杆菌培养。使用这些培养物(1:100稀释于LB+抗生素中)来生成用于最终诱导的新起子培养物。在振荡下在37°C下孵育起子培养物2.5小时(0D_为约0.5)。添加鼠李糖(0.2%的终浓度)，将培养移到25°C下，并在振荡下孵育18小时。 [0774]为生成裂解物，将 50 μ L0.5Χ FASTBREAK™Ce 11 裂解试剂(Promega Corp.)添加到950 μ L的诱导的培养物中，并将混合物在22°C下孵育30分钟。然后如先前所描述的利用TEV蛋白酶消化50 μ L的裂解的培养物，并在室温下孵育2小时。 [0775]为 了分析，将裂解物 1:10，000 稀释于 Hillo Mammalian Purification Buffer (Promega Corp.)中，并在50 μ L的测定试剂(如先前所描述的；100 μ M PB1-3939)中对50 μ L进行测定。在5分钟时间点处测量基底发光和TEV诱导的发光(图73F)并如先前所描述的确定应答(图73G)。 [0776] 图73A-D显示了在小麦胚芽提取物中表达的不同的CP-TEV蛋白酶L27V构建体的基底发光。图73Ε总结了对TEV蛋白酶应答的衍生的CP变体(应答为倍数降低)，表明CP变体可用作TEV感受器，S卩，其可代表“系链依赖性”。利用学生检验(不成对P值；置信水平0.03)进一步验证显示至少1.2倍数改变的变体的显著性。这些结果表示每个CP变体能够生成发光。 [0777] 在ΗΕΚ293细胞中表达不同的CP-TEV蛋白酶L27V构建体。使用先前所描述的反向转染方案来利用I μ g的载体DNA来转染IngDNA/孔。在12孔平板中的ImL的培养基中培养每个细胞样品。通过去除培养基并添加ImL的IX PLB来制备细胞裂解物。在1XPBS+0.1%明胶中1:10稀释样品。建立用于TEV消化的40 μ L的稀释样品。如先前所描述的将10 μ L的消化反应物添加到40 μ L的不含酚红的DMEM和50 μ L的ΡΒΙ-3939中。图73Η显示了在ΗΕΚ293细胞中表达的不同的CP-TEV蛋白酶L27V构建体的发光。 [0778] 图73Α-Η中的数据表明L27V变体可在不同的位点循环交换，且不同的位点具有与系链长度相关的不同的依赖性。哺乳动物细胞数据和小麦胚芽数据显示了利用TEV裂解的相似的倍数降低。更依赖系链，即，对TEV蛋白酶裂解更敏感的CP L27V变体是PCA的潜在的候选物。较不依赖系链的CP L27V变体可能是自互补/ 二聚化测定的潜在候选物。 [0779] 实施例49——蛋白互补测定 [0780] 蛋白互补测定(PCA)提供了检测两个生物分子即多肽的相互作用的工具。PCA利用相同的蛋白例如酶的两个片段，当将所述两个片段互相密切接近时其可重新构成为功能性的活性的蛋白。可在耐受分离的位点将本发明的OgLuc变体分为两个片段。然后，分离的OgLuc变体的每个片段可与认为可相互作用的一对感兴趣的多肽(例如，FKBP和FRB)其中之一融合。若感兴趣的两种多肽确实事实上相互作用，则OgLuc片段相互密切接近而重新构成功能性的活性的OgLuc变体。然后利用天然的或已知的腔肠素或本发明的新型腔肠素可检测和测量重新构成的OgLuc变体的活性。在另一个例子中，剪接OgLuc变体可用于与 Iac-Z (Langley 等，PNAS，72:1254-1257 (1975))或核糖核酸酶 S (Levit 和 Berger,J.Biol.Chem.,251:1333 - 1339(1976))相似的更通用的互补系统中。尤其是，可将已知与另一 OgLuc变体片段(“B”)互补的OgLuc变体片段(命名为“A”)与靶蛋白融合，并通过含片段B的细胞或细胞裂解物中的发光来监测所得的融合体。片段B的来源可以是相同的细胞(在染色体中或在另一质粒上)，或其可以是来源于另一细胞的裂解物或纯化的蛋白。利用片段B和多肽诸如能够附着于固体载体的HALOTAG®.之间的融合可捕捉或固定该相同的融合蛋白(片段A)。然后可利用发光来证明成功的捕捉或定量所捕捉的物质的量。用于蛋白互补的根据制造商的方案可根据美国公布申请第2005/0153310号来进行，其通过引用并入本文。 [0781] 1.如下生成9B8opt PCA构建体:[0782] -p9B8PCAl/4=pF5A/Met-[9B8opt(51-169)]-GGGGSGGGSS-FRB(SEQ ID NO:331 和332)&pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt(1-50)](SEQ ID N0:337 和 338) [0783] -p9B8PCAl/2=pF5A/Met-[9B8opt(51-169)]-GGGGSGGGSS-FRB(SEQ ID NO:331 和332)&pF5A/[9B8opt(1-50)]-GGGGSGGGSS-FRB(SEQ ID N0:333 和 334) [0784] -p9B8PCA2/3=pF5A/[9B8opt(1-50)]-GGGGSGGGSS-FRB(SEQ ID NO:333 和334)&pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt(51-169)](SEQ ID N0:335 和 336) [0785] -p9B8PCA3/4=pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt(51-169)](SEQ ID N0:335 和336)&pF5A/FKBP-GGGSSGGGSG-[9B8opt(1-50)](SEQ ID N0:337 和 338) [0786] 根据制造商的说明利用FUGENE® HD将PCA构建体转染到96孔平板中的HEK293细胞中(15，000个细胞/孔)。然后在37°C、5%C02下过夜孵育细胞。转染后，将细胞上的培养基用含10%FBS的不依赖CO2的培养基来替代。然后添加含20 μ M PB1-3939的测定试剂，并28°C下在Varioskan Flash上测量发光。然后将100 μ M雷帕霉素添加到孔中，并持续测量发光I小时。通过用给定的孔的所有发光除以相同的孔的雷帕霉素预处理的发光来计算倍数应答(图74)。 [0787] 2.为证明OgLuc变体在PCA中的用途，将L27V02A变体片段与FKBP或FRB互补，并测量FKBP和FRB之间的相互作用。 [0788] 表42列出了生成并检验的不同的蛋白互补(PCA)构建体。“2/3”代表变体互补配对，其中1)L27V02A的“旧” C-末端(“旧”=L27V02A的原始C末端)是FKBP的C-末端伴侣；和2)L27V02A的“旧”N-末端是FRB的N-末端伴侣。“ 1/4”表示变体配对，其中I)L27V02A的“旧” N-末端是FKBP的C-末端伴侣；和2) L27V02A的“旧” C-末端是FRB的N-末端伴侣。对于所有构建体，FKBP位于L27V02A片段的N-末端，和FRB位于L27V02A片段的C-末端。例如，生成了在第157位(参见表42，“2/3”和“1/4” #sll和12 (SEQ IDNO:288-295))，第 103 位( 参见表 42，“2/3” 和 “ 1/4”#s9 和 10 (SEQ ID NO:296-303))和第84位(参见表42，“2/3”和“1/4” #s7和8 (SEQ ID NO: 304-315))具有剪接位点的PCA构建体。生成了其他PCA构建体(SEQ ID NO: 343-426和428-440)(参见表21)。 [0789]表 42 [0790] [0791]表 21 [0792] [0794] [0795] 将表42中所描述的互补对如先前所描述的克隆到pF4Ag载体中。然后在兔网织红细胞裂解物(RRL ;Promega Corp.)或小麦胚芽提取物(Promega Corp.)中表达PCA构建体(900 μ L)。将关于每个PCA对的1.25 μ L的表达反应物与10 μ L的2Χ结合缓冲液(IOOmMHEPES, 200mM NaCl, 0.2%CHAPS, 2mM EDTA, 20% 甘油，20mMDTT，ρΗ7.5)和 7.5 μ L 水相混合，并将18 μ L转移到96孔平板的孔中。添加2 μ L的5 μ M的雷帕霉素(终浓度为0.5 μ Μ)并在室温下孵育10分钟。 [0796] 孵育后，添加100 μ L的PB1-3939 (50Χ贮存液在测定缓冲液中稀释至IX)并在室温下孵育3分钟。如先前所描述的测量发光(图76Α-Β:小麦胚芽；图76C-D:兔网织红细胞；图76E-F:无细胞系统[哪种系统？ WG或RRL ?];图76G:ΗΕΚ293细胞)。 [0797] 图76A-G显示了不同的蛋白互补(PCA) L27V对的发光:如所描述的利用2/3配置(图76Α和76C)或1/4配置(图76Β和76D)将每对的一个L27V片段与FKBP或FRB融合，和在小麦胚芽提取物(图76Α和76Β)和兔网织红细胞裂解物(RRL)(图76C和76D)中所监测的FKBP和FRB的相互作用；和不同的蛋白互补(PCA)阴性对照的发光(图76Ε)。测量了在无细胞系统(RRL)(图76F)和ΗΕΚ293细胞(图76G)中利用1/4配置的不同的蛋白互补L27V的发光。图76A-G中的数据表明了多种不同的缺失(即，L27V变体的小片段)是功能性的。 [0798] 3.为表明PCA构建体对基于细胞的PCA的用途，将构建体转染到ΗΕΚ293细胞中并利用ΡΒΙ-4377进行测定。将来自每个PCA对(6、12、55、84和103)的质粒DNA(5ng)与40ng载体DNA(pGEM-3fz)和5 μ L OPT丨-ΜΕΜ_:Φ相混合并在室温下孵育5分钟。然后添力口 FUGENE® HD (0.15 μ L)并再次在室温下孵育15分钟。将DNA转染混合物添加到含10%FBS的DMEM (无抗生素)的100 μ L ΗΕΚ293细胞(1.5x10s个细胞/mL)中，并转移到96孔平板的孔中，并在37°C、5%C02下孵育过夜。 [0799] 转染后，去除培养基并用含20 μ M或50Χ ΡΒΙ-4377的不依赖CO2的培养基来替代并在无CO2调节的情况下在37°C下孵育2小时。测量发光，添加10 μ L雷帕霉素，并每2分钟再次测量发光，持续2小时(图76A-C)。 [0800] 4.为证明PCA构建体用于鉴定蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的用途，使用该实施例的#2中所描述的构建体。 [0801] 如先前所描述的将表42中所描述的互补对103 “2/3”，157 “2/3”，103 “1/4”和157“1/4”克隆到？?4么8载体中。然后根据制造商的说明在兔网织红细胞裂解物中表达PCA构建体(25 μ L) (RRL ；Promega Corp.)。将关于每种PCA的1.25 μ L的表达反应物与10 μ L的 2Χ 结合缓冲液(IOOmM HEPES,200mM NaCl, 0.2%CHAPS,2mM EDTA，20% 甘油，20mM DTT,pH7.5)和7.5 μ L水相混合，并将16.2 μ L转移到96孔平板的孔中。利用不同的量的FK506检查雷帕霉素。向该反应中添加FRB-FKBP结合抑制剂，FK506 (IOX)，并在室温下孵育反应10分钟。添加15ηΜ雷帕霉素(·10Χ贮存液)以获得1.5ηΜ雷帕霉素的终浓度并在室温下孵育2小时。孵育后，添加100 μ L的ΡΒΙ-3939(50Χ贮存液在测定缓冲液中稀释至IX)并在室温下孵育3分钟。在GLOMAX®_光度计上测量发光。图77证明了本文所公开的PCA构建体可用于鉴定蛋白-蛋白相互作用的抑制剂。 [0802] 5.为证明裂解形式的PCA构建体的用途，将互补对103 “ 2/3 ”，157 “ 2/3 ”和103 “1/4”转染到HEK293细胞中并利用PB1-3939进行测定。将来自每个PCA对的0.5ng质粒与5 μ L ΟΡΤΙ-ΜΕΜ®:和49ngpGEM-3zf (Promega Corp.)相混合。将样品混合物在 室温下孵育5分钟。然后将0.15 μ L FUGENE® HD添加到样品混合物中并在室温下孵育15分钟。将100 μ L含10%FBS的DMEM中的HEK293细胞以1.5x10s个细胞/mL添加到每个样品混合物中。然后将细胞样品转移到96孔平板的孔中并在37°C、5%C02下孵育过夜。 [0803] 第二天，将11.1yL的10 μ M雷帕霉素(终浓度I μ Μ)添加到一半的孔中并将11.1yL水添加到另一半的孔中。在37°C下孵育96孔平板I小时。将100 μ L的测定试剂+ΡΒΙ-3939 (先前所描述的，2 μ L50XPB1-3939与98 μ L测定试剂相混合)添加到每个孔并在37°C下孵育平板4分钟。在37°C下，在GLOMAX漱光度计上以0.5s积分时间和I读数测量发光。(图76H)。 [0804] 实施例50-OgLuc cAMP生物感受器 [0805] 不仅通过浓度，还通过酶活性的调节，可将本发明的OgLuc变体与光输出相连接。例如，通过将来自蛋白激酶A的cAMP-结合结构域掺入到循环交换的OgLuc变体中而开发cAMP生物感受器。通过本领域中已知的方法(例如，美国公开申请第2005/0153310号)可将本发明的OgLuc变体在耐受交换的位点进行循环交换。所得的循环交换的OgLuc变体嵌合蛋白当在哺乳动物细胞中表达时可作为cAMP的细胞内生物感受器而行使功能。cAMP与生物感受器结合后，生物感受器经历了构象改变，产生了活性的荧光素酶。用腺苷酸环化酶毛喉素处理细胞，应导致随毛喉素的增加的浓度的发光的增加。靶标包括但不限于钙(Ca+2)，cGMP和蛋白酶诸如半胱天冬酶和烟草蚀纹病毒(TEV)的相似的生物感受器可通过将适当的结合结构域或每种的裂解位点掺入到循环交换的OgLuc变体来开发。 [0806] 通过分析cAMP感受器环境中的变体9B8opt证明了作为生物感受器的OgLuc的应用。生成了含侧翼为OgLuc变体序列的蛋白激酶A的RII β B亚基的循环交换的构建体，并如PCT申请PCT/US2007/008176中所描述的在无细胞系统中表达，不同的是如以下所描述的选择用于循环交换的位点。在存在和不存在cAMP时测定新生蛋白。按活性(+)cAMP/(_)cAMP的比率确定对cAMP的应答。 [0807] 基于先前在PCT/US2010/33449中所描述的，与已知结构的某些脂肪酸结合蛋白的相似性，已构建了 OgLuc的结构模型。模型预测标准蛋白结构基序的有序的序列；α -螺旋和β_片层。选择了在这些结构元件之间过渡的区域作为循环交换位点(参见表43)。 [0808] 1.用于表达生物感受器构建体的模板由以下组成:质粒pF5 (Promega Corp.)中的 C-末端 OgLuc 序列-RII β B 序列-N-末端 OgLuc 序列。TNT® T7Coupled WheatGerm Extract System (Promega Part#L4140)用于翻译该构建体。TNT® Wheat GermExtract Reaction 含 25 μ L TNT® Wheat Germ Extract (L411A), 2 μ L Ί N I ]< ReactionBuffer (L462A)，I μ L Amino Acid Mixture, Complete (L446A)，I μ L RNasiil®- (40U/ μ L) (N2615)，I μ L TNT® T7RNA聚合酶(L516A) ,l.0yg DNA模板且用无核酸酶的水使总体积增加至50 μ L。在30°C下孵育反应混合物120分钟。 [0809] 通过向50 μ L OgLuc翻译混合物中添加含或不含100 μ M cAMP的50 μ LOgLuc Glo ReagentdOOmM MES (ρΗ6.0), ImM CDTA，150mM KCl，35mM 硫脲，2mM DTT, 0.25% TERGITOL® NP-9 (v/v)，0.025% MAZU® DF204 和 20 μ M PB1-3939)来进行OgLuc活性测定，并进行动力学读数30分钟(TCCAN® INFINITE® F500平板阅读器)。通过用由含CAMP的生物感受器生成的发光除以由不含cAMP的生物感受器生成的发光来确定应答(表43)。 [0810] 表43:循环交换的OgLuc生物感受器对cAMP的应答 [0811] [0812] 2.如I中所描述在CP位点51处构建循环交换的9B8opt的cAMP生物感受器。然后根据制造商的说明利用FUGENE® HD将生物感受器转染到96孔板中的HEK293细胞中(15，000个细胞/孔)中，并在37°C、5%C02下过夜孵育。转染后，去除培养基并用含10%FBS的不依赖CO2的培养基来替代。然后在37°C、5%C02下孵育细胞2小时，之后添加不同浓度的FSK。然后再次在37°C、5%C02下孵育细胞3小时。然后添加6 μ M ΡΒΙ-3939，13分钟后测量发光(图78)。[0813] 3.将循环交换的(“CP”;例如CP6指旧的第6位残基成为蛋氨酸之后的新的第I位残基)和直接剪接的(“SS”;例如，SS6指如下定位的感受器=OgLuc (1-6)-RIIPb结合位点(SEQ ID NO: 441 和 442)-OgLuc (7-169))形式的 L27V 用作 cAMP 生物感受器(SEQ IDNO:467-574) „如先前所描述的衍生L27V变体的CP (SEQ ID NO:467-498和555-574)和SS(SEQ ID NO:499-554)形式并根据制造商的说明在兔网织红细胞裂解物(RRL5PromegaCorp.)中表达。RII β b结合位点的C-末端和OgLuc荧光素酶序列之间的接头序列为GGGTCAGGTGGATCTGGAGGTAGCTCTTCT (SEQ ID NO: 575)。RII β b 结合位点的 N-末端和 OgLuc 荧光素酶序列之间的接头序列为AGCTCAAGCGGAGGTTCAGGCGGTTCCGGA(SEQ ID N0:576)将 3.75 μ L的表达反应物与1.25 μ L4X cAMP(终浓度InM-0.1mM)相混合并在室温下孵育15分钟。孵育后，添加ΙΟΟμ L的PB1-3939(50X贮存液在测定缓冲液中稀释为IX)并在室温下孵育3分钟。在GL,(.)MAX®光度计上测量发光(图79A-B)。还测量了在HEK293细胞中表达并如先前所描述的用毛喉素处理的L27V变体的CP和SS形式的发光(图79C-D)。图79A-D表明本文所公开的OgLuc变体的循环交换形式和直接剪接形式可用作生物感受器。 [0814] 实施例51——亚细胞分布和定位 [0815] 为分析亚细胞分布，将U20S细胞以2xl04个细胞/cm2接种到玻璃底培养皿中的含10%FBS的McCoy’s5A培养基中(Invitrogen)。然后在37°C、5%C02下孵育细胞24小时。然 后利用1/20体积转染混合物(FUGENE® HD和克隆到含CMV启动子(Promega Corp.)的 pF5A载体中的 pF5A-CMV-L27V(L27V 变体(SEQ ID NO: 88))或 pGEM3ZF (Promega Corp.；阴性对照))转染细胞，并在37°C、5%C02下孵育24小时。孵育后，用含0.5%FBS和100 μ MΡΒΙ-4378的不依赖CO2的培养基来替代细胞培养基。在37°C下孵育30分钟后，在OlympusLV200生物发光显微镜上利用60X目镜捕捉未滤过的图像(图80A-B)，持续25，100，1000和 5000ms。 `[0816] 为分析亚细胞定位，利用GSSG接头(SEQ ID NO:457和458)生成含具有IL-6分泌序列(SEQ ID N0:461 和 462)或转录因子 Nrf2 (SEQ ID N0:317)的 GPCR AT1R(血管紧张素I型受体(SEQ ID NO:459和460))的N-末端L27V融合体，并如先前所描述的转染到U20S细胞中(图81A-C)。图81C( “GPRC”)显示了构建体的表达，其中IL6信号序列在L27V变体序列的上游，和ATlR在L27V变体序列的下游。还转染了单独的L27V变体(“未融合的”)。在37°C、5%C02下孵育24小时后，用含0.5%FBS的不依赖CO2的培养基替代细胞培养基并在37°C下在非CO2调节的气氛中平衡I小时。然后添加等体积的培养基+200 μ MΡΒΙ-3939，立即在Olympus LV200生物发光显微镜上利用60X或150X目镜捕捉未滤过的图像(图81A-C)。对于表达单独的L27V的细胞，将PB1-3939洗离细胞并立即捕捉图像。 [0817] 实施例52——监测细胞内信号途径 [0818] 该实施例提供了用于在蛋白水平上监测细胞内信号途径的新颖荧光素酶的两个例子(与代表转录激活的应答元件例子形成对比)。将变体9B8opt(SEQ IDNO:24)与 IkB(Gross 等，Nature Methods 2(8):607-614(2005))融合(在 C-末端，即，N-1kB- (9B8opt) -C))或与ODD (Hif-1- α的氧依赖的降解结构域(Moroz等，PLoS0ne4 (4): e5077 (2009))融合(在 N-末端，即，N- (9B8opt) -0DD-C))。已知在用 TNF α 刺激后IKB在细胞中降解；因此，IKB-(9B8opt)构建体可用作活细胞TNF α感受器。已知在用诱导缺氧的化合物刺激后ODD (Hif-1-α )在细胞中蓄积；因此0DD-(9B8opt)可用作活细胞缺氧感受器。 [0819] 如先前所描述的通过逆向转染(5ng (IkB)或0.05ng (ODD) DNA (与载体DNA混合以得到总共50ng))在HEK293细胞中表达含IkB或ODD与9B8opt (pF5A)的融合体的构建体并在37°C、5%C02下孵育24小时。转染后，用含0.5%FBS和20 μ M ΡΒΙ-4377的新鲜的不依赖CO2的培养基替代培养基并使其在37°C、C02气氛下平衡4小时。然后将细胞暴露于刺激物:TNF α用于IkB融合体表达细胞和菲咯啉用于ODD融合体表达细胞。将DMSO (运载体)添加到对照细胞。对于TNF a /IKB样品，在添加刺激物之前约15分钟添加100 μ g/mL环己酰亚胺以防止新蛋白的合成。在指定的时间点处理后，测定细胞的发光。对于数据标准化，将给定时间点的每个样品的RLU除以来自紧接刺激后的相同样品的RLU。然后确定每个感受器的倍数应答(图82A-C)。 [0820] B.使用L27V来在蛋白水平上监测氧化应激信号途径。将L27V或海肾属荧光素酶(Rluc)与pF5K表达载体中的Nrf2/NFE2L2融合(在C-末端；即，N-Nrf2-(L27V)-C或N-Nrf 2-(Rluc)-C)。Keapl是Nrf 2 (SEQ ID N0:217)的负向调控子。为忠实地代表Nrf2-L27V02蛋白水平的调控，共表达Keapl以维持Nrf2低水平(通过泛素化)。 [0821] 通过如先前所描述的在接种到96孔平板中同时转染细胞而在HEK293细胞中表达 Nrf2-L27V 或 Nrf2-Rluc (5ng, pF5K)和 IIALOTAGl1-Keapl 融合蛋白 (pFN21-HT7-Keapl(SEQ ID N0:316) ;50ng)，并在 37°C、5%C02 下孵育 24 小时。转染后，用含 0.5%FBS 和 2O μ M ΡΒΙ-4377 (对于 LW)或 2O μ M ENDUREN™ (Promega Corp.)(对于海肾属荧光素酶)的新鲜的不依赖CO2的培养基替代培养基，并在37°C下在CO2气氛中平衡细胞4小时。为进行动力学分析，使用20 μ M D，L萝卜硫素或运载体(DMSO)。在图83Α中，如先前所描述的在指定的时间点处理后测量发光。为进行数据标准化，将给定时间点的每个样品的发光除以来自紧接刺激后的相同样品的发光(图83B-C)。 [0822] C.进行B中所描述的Nrf2感受器和Nrf2 (ARE) _Luc2P报告子(Promega Corp.)的应答的对比。如先前在以上章节B中所描述的筛选Nrf2感受器和报告子。对于萤火虫(Luc2P)报告子基因测定，使用0NE-GL0™测定试剂。图84A-B提供了 Nrf2_L27V在2小时的标准化应答和Nrf 2 (ARE)-Luc2P在16小时的标准化应答。 [0823] 实施例53——OgLuc变体作为利用BRET的生物发光报告子的评估 [0824] 生物发光共振能量转移(BRET)允许监测蛋白-蛋白相互作用。在IV和HT7融合伴侣之间检查分子内能量转移，其中HT7先前已标记有荧光团，即，TMR(激发/发射(激发/发射)波长=555/585nm)或罗丹明110 (激发/发射波长=502/527nm)。将含实施例34的IV-HT7融合蛋白的50 μ L细菌细胞裂解物与0.001-10 μ M荧光团配体或无配体在室温下孵育I小时。孵育后，将含22 μ M腔肠素-h的50 μ L的RENILLA-GL0™添加到50 μ L的酶-配体混合物中，并在5分钟时记录发射波长。显示了具有TMR(图83Α)或罗丹明110 ( “RhodllO”)(图85B)的IV-HT7的示例的波长，表明当配体的激发/发射接近OgLuc的460nm发光峰值时，BRET更大，S卩，利用罗丹明110更大。该数据显示了融合蛋白上的分子内能量转移可发生在OgLuc变体和荧光团之间。使用三种不同的对照用于比较(数据未示出):I)无HT融合体，2)未用HT配体标记的HT-融合体，和3)在OgLuc和HT之间的TEV位点处蛋白裂解的标记的HT-融合体(其指示了涉及的接近/距离)。在三种不同的对照中未观察到BRET，表明 HT参与实现BRET。与N-末端HT7相比较对于C1+A4E和具有C-末端HT7的IV，BRET更大。 [0825] 实施例54——活细胞或裂解形式的蛋白接近测定 [0826] 在一个例子中，将循环交换的(CP)或直接剪接的(SS)OgLuc融合体蛋白应用于蛋白接近的测量。通过插入蛋白酶底物氨基酸序列(例如，TEV)来交换或剪接OgLuc以生成低的生物发光。无活性的荧光素酶被系链(例如，经由基因融合)于监测蛋白。可能的相互作用蛋白被系链(例如，经由基因融合)于蛋白酶(例如，TEV)。当两个监测蛋白相互作用或处以足够接近时(例如，经由组成型相互作用，药物刺激或途径应答)，荧光素酶被裂解以生成增高的生物发光活性。该例子可应用于细胞中或生物化学测定中的蛋白接近的测量。并且，OgLuc变体荧光素酶的高热稳定性可能能够在裂解的细胞或生物化学测定中测量抗体-抗原相互作用。 [0827] 实施例55——生物发光测定 [0828] 1.为确定OgLuc变体在检测半胱天冬酶-3的生物发光测定中的用途，利用包括DEVD半胱天冬酶-3裂解序列的前腔肠素底物将9B8opt变体用于生物发光测定中。将纯化的半胱天冬酶-3与表达变体9B8opt的大肠杆菌裂解物样品相混合，所述大肠杆菌裂解物样品如实施例27中所描述的来制备，并10倍稀释于含IOOmM MES pH6.0, ImM CDTA，150mMKCl，35mM硫脲，2mM DTT，0.25% TERGITOL® NP-9 (v/v)，0.025% MAZU® DF204,具有或不不具有含于IOOmM HEPES pH7.5中的23.5 μ M z-DEVD-腔肠素_h的缓冲液中。在室温下利用裂解物样品将半胱天冬酶-3孵育3小时，并在不同的时间点在Turner MODULUS™光度计上检测发光。将仅含细菌裂解物的样品和仅含半胱天冬酶-3的样品用作对照。使用三个重复。图86和表44证明9B8opt和进而本发明的其他OgLuc变体可利用前-腔肠素底物用于生物发光测定中以检测感兴趣的酶。 [0829] 表44:从利用z-DEVD-腔肠素_h作为底物与纯化的半胱天冬酶_3 —起孵育或不一起孵育的表达9B8opt的细菌裂解物中生成的以RLU计的平均发光。 [0830] Wfg](分钟)I无半胱天冬酶(RLU) I+半胱天冬酶(RLU) 5_26, 023_25, 411_ 15.3 —7,707 36,906 29.9 一 4,013 41,854 60.9 —2, 305 43, 370 190.3 丨1，155 丨42，448 [0831] 2.利用包括DEVD半胱天冬酶_3裂解序列的前腔肠素底物将L27V变体用于生物发光测定中。将IOOmM MES pH6 (50 μ L)中纯化的半胱天冬酶_3 (lmg/mL)与测定缓冲液(50 μ L)中的227nM L27V02变体和47 μ M ΡΒΙ-3741 (z-DEVD-腔肠素_h)相混合。在室温下孵育反应3小时，并如先前所描述的检测发光。将利用L27V变体的测定与萤火虫荧光素酶形式的测定相比较，CASPASE-GLO® 3/7-测定系统(Caspase-Glo ;Promega Corp.) „表45表明L27V变体，和从而本发明的其他的OgLuc变体可利用前腔肠素底物用于生物发光测定中以检测感兴趣的酶。 [0832]表 45 [0833] [0834] 实施例56——免疫测定 [0835] 可将本发明的OgLuc变体融入到多种不同的免疫测定概念中。例如，OgLuc变体是与一抗或二抗基因融合的或化学轭合的以为特定的分析物提供检测方法。作为另一个例子，OgLuc变体是与蛋白Α、蛋白G、蛋白L或已知结合Ig片段的任何其他肽或蛋白基因融合的或化学轭合的，且然后这可用于检测与特定的分析物结合的特定的抗体。作为另一个例子，OgLuc变体是与链酶亲和素基因融合的或化学轭合的并用于检测与特定的分析物结合的特定的生物素化的抗体。作为另一个例子，OgLuc变体的互补片段是与一抗和二抗基因融合的或化学轭合的，其中一抗识别特定的固定的分析物，且二抗识别一抗，均为ELISA样的形式。OgLuc变体活性，S卩，发光，在固定的分析物存在时重新构成并用作定量分析物的工具。 [0836] 作为另一个例子，OgLuc变体的互补配对可与两个抗体融合，其中一个抗体在一个表位处识别特定的分析物，且二抗识别分开的表位处的分析物。OgLuc变体活性将在分析物存在下重新构成。方法将顺从于复杂环境诸如细胞裂解物或细胞培养基中的分析物定量的测量。作为另一个例子，OgLuc变体的互补片段将与两个抗体融合，其中一个抗体识别特定的分析物，无论修饰与否，且二抗仅识别修饰的分析物(例如，翻译后修饰后)。OgLuc变体活性将在仅当其被修饰的分析物存在时重新构成。方法将顺从于复杂的环境诸如细胞裂解物中的修饰的分析物的测量。作为另一个例子，OgLuc变体将与分析物(例如，前列腺素)轭合并以竞争性三明治ELISA形式来使用。 [0837] 实施例57——二聚化测定 [0838] 该例子证明全长的循环交换的OgLuc变体可与相应的结合伴侣融合，例如，FRB和FKBP，并用于蛋白互补类型测定。本文所公开的根据制造商的方案和传统的蛋白互补之间的关键差异在于不存在互补，而是存在两个全长的酶(例如，循环交换的OgLuc变体)的二聚化。 [0839] 简言之，简单地配置用于低活性的循环交换的蛋白报告子与融合蛋白伴侣的两者融合(参见图87Α)。例如，可将每个融合伴侣与相同结构的、交换的报告子连接。融合伴侣的相互作用使交换的报告子密切接近，从而允许具有更高活性的杂交报告子的重新构成。新型杂交报告子以降低结构限制的方式包括每个循环交换的报告子的部分。 [0840] 根据制造商的说明如先前所描述的克隆循环交换的、直接剪接的L27V变体CP84和 CP103 (N-(SS-169)-(1-SSl)-FRB-C 和 C-(1-SSl) - (SS-169) -FKBP)并在兔网织红细胞裂解物(RRL ；Promega Corp.)中表达(25 μ L)。将每个二聚化对的1.25 μ L的表达反应与10 μ L 的 2Χ 结合缓冲液(IOOmM HEPES, 200mM NaCl, 0.2%CHAPS, 2mM EDTA, 20% 甘油，20mMDTT，pH7.5)和7.5 μ L水相混合，并将18 μ L转移到96孔平板的孔中。向该反应添加2 μ L雷帕霉素(终浓度O和0.1-1OOOnM)，并在室温下孵育反应10分钟。孵育后,添加100 μ LPB1-3939 (50X贮存液在测定缓冲液中稀释至IX)并在室温下孵育3分钟。在GLOMAX®.光度计上测量发光(图87B)并确定应答(图87C)。图87B-C证明本发明的OgLuc变体可用于通过PCA-型二聚化测定检测蛋白-蛋白相互作用。 [0841 ] 实施例58——细胞内半衰期 [0842] 确定了 OgLuc变体9B8，9B8+K33N，V2，L27V和V2+L27M的细胞内半衰期。根据制造商的说明利用 TRANSITCD-LTI (Mirus)利用含 9B8，9B8+K33N，V2，L27V( “V2+L27V”)或V2+L27M (均在pF4A载体背景中)的30 μ LlOOng/μ L质粒DNA转染15_100mm平板中的含10%FBS和IX丙酮酸钠的F12培养基中的CHO细胞(500，000)。然后将细胞孵育6小时。 [0843] 孵育后，去除培养基并添加ImL胰酶以将细胞从平板脱离。然后添加3mL的F12培养基，并计数细胞。然后将细胞以10，000个细胞/孔接种到96孔平板的6个孔中(6孔/变体)并在37°C下孵育过夜。将样品分配覆盖3个平板。每个平板具有不同的时间点测量的6个重复。 [0844] 过夜孵育后，从细胞中去除培养基用于t=0样品，并添加100 μ L测定缓冲液(先前所描述的；无底物)。在干冰上冷冻样品并贮存于-20°C。在OPT1-MEM®中将环己酰亚胺(100mg/mL) 1:100稀释至终浓度lmg/mL。同样在OPT1-MEM®中将DMSO(100%) 1:100稀释(终浓度1%)。将稀释的环己酰亚胺(lmg/mL) (11 μ L)添加到每个转染的变体样品的3个重复中并将IlyL的稀释的DMS0(1%)添加到另外3个重复中。然后在37°C、5%C02下孵育细胞并在不同的时间点(S卩，0，0.5，0.9，2.5，4.3和6.2小时)移出并处理作为t=0样品。 [0845] 为了分析，将细胞融化至室温，并在50 μ L测定试剂中测定10 μ L。在GLOMAX®光度计上测量发光。在每个时间点，关于未处理的和环己酰亚胺处理的样品测量发光。通过未处理的细胞的RLU对利用环己酰亚胺处理的细胞的RLU进行标准化。 [0846] 在每个时间点通过测量来自环己酰亚胺(CHX)处理的发光与未处理的发光的比率计算每个变体的细胞内半衰期。然后绘制随时间推移比率的自然对数(处理的比未处理的％)，并计算半衰期(表46)。OgLuc变体利用完整强度的CMV启动子具有约6-9小时的细胞内半衰期，但利用CMV缺失变体(d2)半衰期下降了。与完整强度的CMV启动子组合的PEST降解信号的存在显著降低了半衰期。 [0847] 表 46 [0848] [0849] 利用ΗΕΚ293细胞利用实施例52中描述的逆向转染方案完成了另一实验(数据未示出)。来自该实验的结果表明具有PEST的L27V变体的细胞内半衰期是10分钟。该实验中所用的不含降解信号的L27V变体在该实验的过程中未显示衰减。在该情况下衰减关于t=0时的未处理的细胞标准化。[0850] 实施例59——OgLuc变体暴露于尿素 [0851 ] 由于已知萤火虫荧光素酶是相对不稳定的，其对于尿素暴露是更加敏感的。为确定是否对于OgLuc变体也是此情况，确定了 OgLuc对尿素的敏感性。将5μ I的45.3μΜL27V 酶与 100 μ L 的尿素溶液(IOOmM MOPS, pH7.2, IOOmM NaCl, ImM CDTA，5% 甘油和不同浓度的尿素)相混合并在室温下孵育30分钟。将5 μ L的尿素+L27V酶溶液10，000倍稀释到不含酚红 +0.1% ί!υ\Ι.;X H.的 DMEM 中，将 50 μ L 与含 100 μ M PB1-3939 的 50 μ L 测定试剂(先前所描述的)相混合并在10分钟时读取发光(图88)。图88表明L27V抵抗尿素或在去除尿素后极快地再折叠为功能性酶。这表明当涉及化学变性条件时，例如，在基于OgLuc变体的反应前使用变性来停止酶反应的条件中的多重复合，L27V可用作报告子酶。 [0852] 将0.3 lmg/mL的纯化的L27V变体贮备液100，000倍稀释到缓冲液(PBS+lmMDTT+0.005%IGEPAL)中并在25 °C下与3M尿素一起孵育30分钟，且然后与含100 μ MPB1-3939 (先前所描述的)的测定试剂1:1(50μί+50μυ相混合。如先前所描述的在TECAN® INFINITE® F500光度计上测量反应(持续ioo分钟；1分钟读数间隔)(图89)。结果表明3M尿素降低了 L27V变体的活性约50%，但在稀释尿素2倍后(至1.5M终浓度)，活性增加，可能由于再折叠所导致。 [0853] 实施例60——OgLuc融合蛋白的成像 [0854] 该例子表明了 OgLuc和OgLuc变体用于在活细胞中监测蛋白转位而不需要荧光激发的用途。OgLuc变体与人类糖皮质激素受体(GR ;SEQ ID N0:451和452)，人类蛋白激酶Ca (PKCa ；SEQ ID N0:449 和 450)或 LC3 (SEQ ID N0:577 和 578)相融合。为利用生物发光成像分析亚细胞蛋白转位，将HeLa细胞以2xl04个细胞/cm2接种到玻璃底培养皿(MatTek)中的含10%FBS的DMEM培养 基中。然后在37°C、5%C02下孵育24小时。然后利用1/20体积 转染(FUGENFUID 和克隆到 pF5A 载体(Promega Corp.)中的编码 L27V02_GR(SEQ ID N0:453 和 454)或 L27V02-PKC a (SEQ ID Ν0:455 和 456)的 DNA)混合物转染细胞。用于L27V02-GR 的质粒 DNAl: 20 稀释到 pGEM_3ZF (Promega Corp.)中以获得适当的 L27V02-GR的表达水平。关于L27V02-LC3和L27V02-PKC α的DNA使用未稀释的。然后在37°C、5%C02下孵育细胞24小时。利用补充1%炭/葡聚糖处理的FBS的MEM培养基(Invitrogen)将利用GR融合蛋白转染的细胞对GR激动剂饥饿20小时。转染后24小时(对于PKC α测量)或转染后48小时(对于GR测量)，在紧接成像前用含100 μ M PB1-3939的不依赖CO2的培养基替代细胞培养基。在Olympus LV200生物发光显微镜上利用150X目镜立即捕捉未过滤的图像。 [0855] 通过用0.5mM地塞米松刺激15分钟而实现L27V02-GR融合蛋白的胞质溶胶到核的转位。通过利用IOOnM PMA刺激20分钟而实现L27V02-PKCa融合蛋白的胞质溶胶到质膜的转位。L27V02-LC3融合蛋白转染的细胞不进行处理或利用含10%FBS的DMEM培养基(Invitrogen)中的50mM氯喹处理。 [0856] L27V02-糖皮质激素受体 [0857] 在不存在糖皮质激素时，糖皮质激素受体(GR)与Hsp90蛋白复合并位于胞质溶胶中。GR与糖皮质激素诸如地塞米松相互作用后，GR蛋白从这些蛋白复合物脱离并转位到核以调节基因表达。图90A-B显示了在HeLa细胞中利用PB1-3939底物地塞米松诱导的L27V02-糖皮质激素受体(GR)融合蛋白的胞质溶胶到细胞核受体(NR)转位的生物发光成像。 [0858] L27V02-PKCa [0859] 在用佛波酯处理后，PKCa蛋白募集到质膜并调节细胞应答，包括膜动力学和信号转导。图91A-B显示了在U-20S细胞中利用PBI3939底物OgLuc L27V02-PKC α融合体的佛波酯诱导的蛋白激酶C a (PCKa)胞质溶胶到质膜转位的生物发光成像。 [0860] L27V-LC3 [0861] 加工过的LC-3蛋白与自噬体的解离代表自噬中的标志性步骤。氯喹处理使自噬变化在该阶段停滞，导致了 LC-3蛋白在自噬体上蓄积(产生点状亚细胞分布)。图92A-B显示了在两个代表性的HeLa细胞样品中利用PB1-3939底物OgLuc L27V-LC3融合蛋白(SEQID N0:592和593)的氯喹诱导的自噬体蛋白转位的生物发光成像。 [0862] 表47-附表 [0863] [0864] [0865] 序列表 [0866] SEQ ID NO:1 (天然的成熟OgLuc蛋白)细角剌虾[0867] FTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADIHVIIPYEGLSGFQ [0868] MGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIY [0869] DERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCENILA [0870] SEQ ID NO: 2 (C1A4E 核苷酸) [0871] ATGGTGTTTACATTGGAGGATTTCGTTGGAGACTGGCGGCAGACAGCTGGATACAACCAAGATCAAGTG [0872] TTAGAACAAGGAGGATTGTCTAGTCTGTTCCAAAAGCTGGGAGTGTCAGTCACCCCAATCCAGAAAATT [0873] GTGCTGTCTGGGGAGAATGGGTTAAAATTTGATATTCATGTCATCATCCCTTACGAGGGACTCAGTGGT [0874] TTTCAAATGGGTCTGATTGAAATGATCTTCAAAGTTGTTTACCCAGTGGATGATCATCATTTCAAGATT [0875] ATTCTCCATTATGGTACACTCGTTATTGACGGTGTGACACCAAACATGATTGACTACTTTGGACGCCCT [0876] TACGAGGGAATTGCTGTGTTTGACGGCAAGAAGATCACAGTTACTGGAACTCTGTGGAACGGCAACAAG [0877] ATCATTGATGAGCGCCTGATCAACCCAGATGGTTCACTCCTCTTCCGCGTTACTATCAATGGAGTCACC [0878] GGATGGCGCCTTTGCGAGCGTATTCTTGCC [0879] SEQ ID NO:3 (C1A4E 蛋白) [0880] MVFTLEDFVGDW RQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQKLGVSVTPIQKIVLSGENGLKFDIHVIIPYEGLSG[0881 ] FQMGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNK [0882] IIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA [0883] SEQ ID NO:4(QC27 核苷酸) [0884] ATGGTGTTTACATTGGAGGATTTCGTTGGAGACTGGCGGCAGACAGCTGGATACAACCTAGATCAAGTG [0885] TTAGAACAAGGAGGATTGTCTAGTCTGTTCCAAAAGCTGGGAGTGTCAGTCACCCCAATCCAGAAAATT [0886] GTGCTGTCTGGGGAGAATGGGTTAAAAATTGATATTCATGTCATCATCCCTTACGAGGGACTCAGTGGT [0887] TTTCAAATGGGTCTGATTGAAATGATCTTCAAAGTTGTTTACCCAGTGGATGATCATCATTTCAAGATT [0888] ATTCACCATTATGGTACACTCGTTATTGACGGTGTGACACCAAACATGATTGACTTCTTTGGACGCCCT [0889] TACGAGGGAATTGCTGTGTTTGACGGCAAGAAGATCACAGTTACTGGAACTCTGTGGAACGGCAACAAG [0890] ATCATTGATGAGCGCCTGATCAACCCAGATGGTTCACTCCTCTTCCGCGTTACTATCAATGGAGTCACC [0891] GGATGGCGCCTTTGCGAGCGTATTCTTGCC [0892] SEQ ID N0:5(QC27 蛋白) [0893] MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGLSSLFQKLGVSVTPIQKIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSG [0894] FQMGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIIHHYGTLVIDGVTPNMIDFFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNK [0895] IIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA [0896] SEQ ID NO:6 (QC279a 核苷酸) [0897] ATGGTGTTTACATTGGAGGATTTCGTTGGAGACTGGCGGCAGACAGCTGGATACAACCTAGATCAACTG [0898] TTAGAACAAGGAGGATTGTCTAGTCTGTTCCAAAAGCTGGGAGTGTCAGTCACCCCAATCCAGAAAATT [0899] GTGCTGTCTGGGGAGAATGGGTTAAAAATTGATATTCATGTCATCATCCCTTACGAGGGACTCAGTGGT [0900] TATCAAATGGGTCAGATTGAAAAGATCTTCAAAGTTGTTTACCCAGTGGATGATCATCATTTCAAGATT [0901] ATTCGCCATTATGGTACACTCGTTATTGACGGTGTGACACCAAACATGATTGACTTCTTTGGACGCCCT [0902] TACGAGGGAATTGCTGTGTTTGACGGCAAGAAGATCACAGTTACTGGAACTCTGTGGAACGGCAACAAG [0903] ATCATTGATGAGCGCCTGATCAACCCAGATGGTTCACTCCTCTTCCGCGTTACTATCAATGGAATCACC [0904] GGATGGCGCCTTTGCGAGCGTATTCTTGCC [0905] SEQ ID NO: 7 (QC279a 蛋白)[0906] MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQLLEQGGLSSLFQKLGVSVTPIQKIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSG [0907] YQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKIIRHYGTLVIDGVTPNMIDFFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNK [0908] IIDERLINPDGSLLFRVTINGITGWRLCERILA [0909] SEQ ID NO:8 (IVY 核苷酸) [0910] ATGGTGTTTACATTGGAGGATTTCGTTGGAGACTGGCGGCAGACAGCTGGATACAACCAAGATCAAGTG [0911] TTAGAACAAGGAGGATTGTCTAGTCTGTTCCAAAAGCTGGGAGTGTCAGTCACCCCAATCCAGAAAATT [0912] GTGCTGTCTGGGGAGAATGGGTTAAAAATTGATATTCATGTCATCATCCCTTACGAGGGACTCAGTGGT [0913] TTTCAAATGGGTCTGATTGAAATGATCTACAAAGTTGTTTACCCAGTGGATGATCATCATTTCAAGGTT [0914] ATTCTCCATTATGGTACACTCGTTATTGACGGTGTGACACCAAACATGATTGACTACTTTGGACGCCCT [0915] TACGAGGGAATTGCTGTGTTTGACGGCAAGAAGATCACAGTTACTGGAACTCTGTGGAACGGCAACAAG [0916] ATCATTGATGAGCGCCTGATCAACCCAGATGGTTCACTCCTCTTCCGCGTTACTATCAATGGAGTCACC [0917] GGATGGCGCCTTTGCGAGCGTATTCTTGCC [0918] SEQ ID NO:9 (IVY 蛋白) [0919] MVFTLEDFVGDWRQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQKLGVSVTPIQKIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSG [0920] FQMGLIEMIYKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNK[0921 ] IIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA [0922] SEQ ID NO: 10 (IVY+C1.3 核苷酸) [0923] ATGGTGTTTACATTGGAGGATTACGTTGGAGACTGGCGGCAGACAGCTGGATACAACCAAGATCAAGTG [0924] TTAGAACAAGGAGGATTGTCTAGTCTGTTCCAAAATCTGGGAGTGTCTGTCACCCCAATCCAGAAAATT [0925] GTGCTGTCTGGGGAGAATGGGTTAAAAATTGATATTCATGTCATCATCCCTTACGAGGGACTCAGTGGT [0926] TTTCAAATGGGTCTGATTGAAATGATCTACAAAGTTGTTTACCCAGTGGATGATCATCATTTCAAGGTT [0927] 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atcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccct [5069] gtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaac [5070] atgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaaca [5071] gggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggc [5072] SEQ ID NO: 496 (CP148L27V (RIIbB)(氨基酸序列) [5073] MSLLFRVTINGVTGWRLCERILASSSGGSGGSGMYESFIESLPFLKSLEFSARLKVVDVIGTKVYNDGE [5074] QIIAQGDSADSFFIIESGEVKITMKRKGKSEVEENGAVEIARCSRGQYFGELALVTNKPRAASAHAIGT [5075] VKCLAMDVQAFERLLGPCMEIMKRNIATYEEQLVALYGTNMDIVGSGGSGGSSSMVFTLEDFVGDWRQT [5076] AGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLS ⑶ QMGQIEKIFKWYP[5077] VDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDG [5078] SEQ ID NO: 497 (CPl57L27V (RIIbB)(核苷酸序列) [5079] AtGGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCTAGCTCAAGCGGAGGTTCAGGCGGTTCC [5080] GGAATGTATGAAAGCTTTATTGAGTCACTGCCATTCCTTAAATCTTTGGAGTTTTCTGCACGCCTGAAA [5081] GTAGTAGATGTGATAGGCACCAAAGTATACAACGATGGAGAACAAATCATTGCTCAGGGAGATTCGGCT 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附 表 為 分析 甲 戊 等 五種 脊椎動物 在 血紅 素 胺 基 酸的差異 數目 若以 戊 物種為 基準 比對 胺 基 酸差異 的數目 如 附
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